本发明涉及口腔护理产品性能测试技术领域，涉及评价包含白芨提取物的牙膏止血性能，特别涉及构建一种包含白芨提取物的牙膏止血性能体外评价模型，用于评价该牙膏的止血性能。
背景技术：
如今人们的口腔问题如龋齿、口臭、牙龈炎、牙周炎和牙敏感等越来越突出，对口腔护理产品的品质和功能要求也越来越高。但是，验证口腔护理原料及产品的抗炎和修复功能等仍是行业难点，传统的测试方法是通过动物实验进行验证。3月，欧盟化妆品法规(ec)1223/正式实施，要求禁止对化妆品成分进行动物实验，并且禁止对成品或者成分进行过局部/急性动物实验的化妆品销售。显然，对化妆品原料和成品禁止动物实验将是未来趋势。随着口腔护理产品被纳入化妆品管理，如何能更加便捷且有效地筛选原料以及验证产品功效成为业内关注的焦点。
白芨(blettilastriata)，其药用价值从古至今均有明确记载，用于体内外出血症、烧烫伤、抗补体活性、治疗肿瘤等，我国白芨的种植面积位居世界首位，其中许多成分都具有较高药用价值和营养价值，如联苄类和菲类等由于其广泛的医学用途而备受关注，白芨胶粉和白芨葡甘聚糖胶作为医药原料、药用辅料和生物医学材料安全高效且性能好。血小板是一种膜结构的血液成分，在血液中发挥作用，主要是靠多种表面受体及存在于血小板中的可溶性介质来进行。在正常的血液循环过程中，血小板处于稳定的静止状态，当血管壁出现损伤时，通过表面接触和某些凝血因子的作用，血小板转入激活状态，出现凝集现象。白芨可通过增强血小板txa2的活性进而增加txb2含量，缩短凝血酶原时间，抑制纤维蛋白酶活性从而降低血浆中camp含量，使血细胞凝集形成人工血栓达到止血效果。但是，现有技术中仅简述白芨牙膏具有预防口腔出血效果，对其含量没有做过具体比较分析，且对其止血方面的研究较浅显，仅在凝血时间、凝血酶原等方面做局部研究。
技术实现要素：
本发明基于药物研发前期先导化合物筛选的体外细胞实验，立足于白芨提取物的筛选以及其口腔护理产品的功效测试，构建一种包含白芨提取物的牙膏止血性能体外评价模型替代动物实验，用于口腔护理产品原料筛选或产品功效验证，特别用于评价该牙膏的止血性能。
本发明还通过上述体外评价模型可量化评价内含白芨提取物的牙膏止血效果。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
包含白芨提取物的牙膏止血性能体外评价模型，其评价指标包括血小板聚集率、环磷酸腺苷(camp)和血栓素b2(txb2)中至少一种；
所述体外评价模型的构建方法包含以下步骤：
(ⅰ)采集动物动脉血，离心，提取血小板密度为1×1012/l的血浆置于96孔板内，检测其空白时的吸光度od0；
(ⅱ)将包含不同浓度白芨提取物的牙膏样品和对照样品分别加入到步骤(ⅰ)的孔板内，轻微震荡，于37℃恒温孵育至充分反应；和
(ⅲ)加入5ul的10um二磷酸腺苷(adp)溶液，轻微震荡，诱导血小板聚集反应；
(ⅳ)待血小板出现聚集反应，体系内浊度发生变化，测试加入不同样品的血浆经步骤(ⅲ)血小板聚集反应后的吸光度odt、camp和txb2含量，按照如式(1)计算血小板聚集率：
在某些实施方案中，所述动物为雌性新西兰大白兔，且其血浆提取方法为：采集该大白兔动脉血，22℃下900rpm离心8min，将离心后的上层液体缓慢转移，得到富血小板血浆；余下部分用3000rpm离心10min，取上清，得到贫血小板血浆，并调整血小板密度为1×1012/l。
还包括通过动物模型验证所述体外评价模型一致性的步骤。
在某些实施方案中，所述牙膏内白芨提取物的浓度为0.05～0.80重量％。
进一步，所述牙膏内白芨提取物的浓度为0.10～0.40重量％。
上述体外评价模型用于评价包含白芨提取物的牙膏止血性能的方法，通过所述体外评价模型获得所述牙膏样品和对照样品血浆中血小板聚集率、camp和txb2含量，并根据其含量变化评价所述包含白芨提取物的牙膏止血性能。其评价标准包括：
血小板聚集率升高，所述牙膏止血性能好；和/或
txb2含量升高，所述牙膏止血性能好；和/或
camp含量降低，所述牙膏止血性能好。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：不仅有效地减少和避免实验动物的使用，为出口型企业符合欧盟动物实验禁令法规要求提供技术服务，同时也满足部分企业的研发需求，不但可以提高牙膏配方研究工作效率，同时也降低体内试验成本。
附图说明
图1是包含白芨提取物的牙膏对血小板聚集率的影响；
图2是包含白芨提取物的牙膏对adp诱导的血小板分泌txb2的影响；
图3是包含白芨提取物的牙膏对adp诱导的血小板分泌camp的影响；
其中，a-白芨ⅰ号牙膏，b-白芨ⅱ号牙膏，c-阴性牙膏，d-阳性牙膏(氨甲环酸牙膏)，e-白芨提取物，f-生理盐水；p＜0.05用*表示；p＜0.01用**表示；p＜0.001用***表示。
图4是包含白芨提取物的牙膏对大鼠牙龈炎模型bop的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
<材料与方法>
牙膏样品和对照样品分别为：a-白芨ⅰ号牙膏；b-白芨ⅱ号牙膏；c-阴性牙膏；d-氨甲环酸牙膏；还包括：e-白芨提取物和f-生理盐水的对照组，其浓度如表1所示。
牙膏样品前处理：将a～d组牙膏溶于等量无水乙醇中，在60℃加入少量无水硫酸钠搅拌至充分溶解，离心，取上清液后旋蒸(40℃、75rpm)至最初牙膏体积，真空干燥6h，-80℃下冻藏12h，冻干20h，得到牙膏的醇提物，用0.9％的生理盐水或dmem培养基逐步稀释，离心，0.22μm的滤膜过滤，4℃保存，(一周内用完)备用。
表1
adp溶液：称取adp用适量生理盐水溶解，稀释为体系浓度为10umol/l的溶液，-20℃冷藏，备用。
10％水合氯醛(chloralhydrate，ph7.2)：称取5g水合氯醛用适量生理盐水溶解，定容到50ml，4℃冷藏备用。
实施例一牙膏止血性能体外评价模型
构建包含白芨提取物的牙膏止血性能体外评价模型，具体方法为：
采集雌性新西兰大白兔动脉血，22℃下900rpm离心8min，将离心后的上层液体缓慢转移，得到富血小板血浆；余下部分用3000rpm离心10min，取上清，调整血小板密度为1×1012/l，得到贫血小板血浆，将其置于96孔板中，检测空白时的吸光度od0，加入不同样品a～f组(5ul/孔)，轻微震荡。再将装有样品的96孔板于37℃恒温孵育5分钟，充分反应。随后加入5ul的adp溶液，轻微震荡以诱导血小板聚集，待血小板出现聚集反应后，相应体系内的浊度会发生变化。
根据酶标仪测试加入不同样品的血浆经血小板聚集后的吸光度odt，按照如式(1)计算血小板聚集率，按照elisa试剂盒说明书分别检测血浆中camp和txb2的含量：
将实施例一测试所得血小板聚集率、环磷酸腺苷(camp)和血栓素b2(txb2)含量进行分析用于评价包含白芨提取物的牙膏止血性能，具体如下所述。
1.<血小板聚集率>
血小板聚集率是反映血小板凝聚功能的指标，起到止血功能的最早反应，血小板聚集率增高时则呈现血栓状态。样品a、b、c、d、e处理后稀释为0.05％～0.80％，检测其对adp诱导的血小板聚集率的影响。如图1所示，浓度为0.10％～0.40％的牙膏样品效果较显著，浓度为0.20％左右的白芨提取物的血小板聚集率最高，比生理盐水高出为40.47％±4.23％(p＜0.05)。稀释浓度为0.20％的氨甲环酸牙膏的血小板聚集率比阴性对照高37.96％±3.86％(p＜0.05)，其中白芨ⅰ号牙膏和白芨ⅱ号牙膏的血小板聚集率均有显著性增高(p＜0.01)，说明白芨提取物及其牙膏均具有很好的止血效果。
2.<血栓素b2(txb2)>
txb2是血小板花生四烯酸(aa)代谢途径环氧化酶的主要产物之一，白芨提取物及其牙膏和氨甲环酸牙膏可促进血小板环氧化酶，因此检测白芨提取物及其牙膏止血性能体外评价模型中血小板分泌txb2的含量来推断血小板的活性，txb2含量越高表示血小板生理活性越活跃。如图2所示，稀释浓度为0.40％左右的氨甲环酸牙膏组效果最为显著，txb2含量比正常血浆高5.04ng/l±0.42ng/l(p＜0.001)，白芨ⅰ号牙膏和白芨ⅱ号牙膏也能显著性增加txb2含量(p＜0.01)。
3.<环磷酸腺苷(camp)>
在血小板中，camp可通过蛋白激酶a有效地刺激膜上一种蛋白磷酸化，并通过对钙摄入的影响，调节血小板收缩的生理功能，而白芨提取物及其牙膏可抑制蛋白激酶的活化从而影响camp分泌，camp含量越高表示血小板越呈老化状态。如图3所示，0.40％左右的氨甲环酸牙膏组的效果最为显著，camp含量比正常血浆低292.53nmol/l±2.32nmol/l(p＜0.01)，白芨ⅰ号牙膏与白芨ⅱ号牙膏也能显著性减少camp含量(p＜0.01)。
实施例二动物实验
设置牙膏样品组，分别为：a-白芨ⅰ号牙膏组；b-白芨ⅱ号牙膏组；c-阴性牙膏组；d-氨甲环酸牙膏组；e-白芨提取物组；f-对照组；g-空白组。iga:f＝311.7，ap＜0.01，建立动物牙龈炎症模型，通过对x-ray组织观察探针出血指数(bop)和唾液中免疫球蛋白(iga、igm、igg)的含量检测验证上述牙膏止血性能体外评价模型代替体内动物实验的可行性。
iga为分泌性的免疫球蛋白a，是机体抵御病原体的第一道免疫防线，有效地阻止口腔中有害物质进入上皮细胞；igm为免疫球蛋白m，是免疫应答中最早出现的抗体，可根据其含量来评价口腔中牙龈炎的修复作用；igg是免疫球蛋白g，是血清中主要的抗体成分，唾液中含量极低。如表2所示，氨甲环酸牙膏处理后iga的变化最为明显，增加1.18mg/l(p＜0.01)，白芨ⅰ号牙膏处理后igm增加410ng/l(p＜0.01)，而igg在第三周大鼠口腔发炎严重时，由于牙龈易出血导致能在口腔唾液中到大量血清中的igg，但第六周牙膏处理后则恢复正常值。
表2
经测试，白芨ⅰ号牙膏、白芨ⅱ号牙膏、阴性牙膏、氨甲环酸牙膏和白芨提取物稀释在20％～40％时效果最显著((p＜0.05))，其血小板聚集率分别是61.64％、61.26％、57.59％、65.56％、75.23％；camp含量分别为330.61nmol/l、416.56nmol/l、449.78nmol/l、244.60nmol/l、313.41nmol/l；txb2含量分别为6.22ng/l、5.88ng/l、5.43ng/l、10.04ng/l、11.36ng/l，探针出血指数(bop)如图4所示。结果表明，检测出的bop和iga、igm、igg含量均有效地验证牙膏样品在动物体内与体外血小板模型止血效果的一致性。
技术特征：
1.包含白芨提取物的牙膏止血性能体外评价模型，其特征在于，其评价指标包括血小板聚集率、环磷酸腺苷(camp)和血栓素b2(txb2)中至少一种；
所述体外评价模型的构建方法包含以下步骤：
(ⅰ)采集动物动脉血，离心，提取血小板密度为1×1012/l的血浆置于96孔板内，检测其空白时的吸光度od0；
(ⅱ)将包含不同浓度白芨提取物的牙膏样品和对照样品分别加入到步骤(ⅰ)的孔板内，轻微震荡，于37℃恒温孵育至充分反应；和
(ⅲ)加入5ul的10um二磷酸腺苷(adp)溶液，轻微震荡，诱导血小板聚集反应；
(ⅳ)待上述反应体系内浊度发生变化时，测试加入不同样品的血浆经步骤(ⅲ)血小板聚集反应后的吸光度odt、camp和txb2含量，按照如式(1)计算血小板聚集率：
2.根据权利要求1所述的体外评价模型，其特征在于，所述动物为雌性新西兰大白兔，且其血浆提取方法为：采集大白兔动脉血，22℃下900rpm离心8min，将离心后的上层液体缓慢转移，得到富血小板血浆；余下部分用3000rpm离心10min，取上清，得到贫血小板血浆，并调整血小板密度为1×1012/l。
3.根据权利要求1所述的体外评价模型，其特征在于，还包括通过动物模型验证所述体外评价模型一致性的步骤。
4.根据权利要求1所述的体外评价模型，其特征在于，所述牙膏内白芨提取物的浓度为0.05～0.80重量％。
5.根据权利要求1或2所述的体外评价模型，其特征在于，所述牙膏内白芨提取物的浓度为0.10～0.40重量％。
6.权利要求1～5任一项所述体外评价模型用于评价包含白芨提取物的牙膏止血性能的方法，其特征在于，通过权利要求1～5任一项所述体外评价模型获得所述牙膏样品和对照样品血浆中血小板聚集率、camp和txb2含量，并根据其含量变化评价所述包含白芨提取物的牙膏止血性能。
7.根据权利要求6所述评价包含白芨提取物的牙膏止血性能的方法，其特征在于，血小板聚集率升高，所述牙膏止血性能好；和/或
txb2含量升高，所述牙膏止血性能好；和/或
camp含量降低，所述牙膏止血性能好。
技术总结
本发明公开了包含白芨提取物的牙膏止血性能体外评价模型和方法，其评价指标包括血小板聚集率、环磷酸腺苷(cAMP)和血栓素B2(TXB2)含量中至少一种；采集动物动脉血，离心，调整血浆浓度，检测其空白时的吸光度OD0；将包含不同浓度白芨提取物的牙膏样品和对照样品分别加入到装有血浆的孔板内，轻微震荡，37℃恒温孵育充分反应，加入二磷酸腺苷溶液诱导血小板聚集反应；待上述反应体系内浊度发生变化时，测试血浆吸光度ODt、cAMP和TXB2的含量并计算血小板聚集率，用于评估牙膏止血性能。本发明不仅有效地减少和避免实验动物的使用，还可以大大提高牙膏配方研究工作效率，降低体内试验成本。
技术研发人员：吴文惠;郭庆;冯婧文;包斌;郭锐华
受保护的技术使用者：上海海洋大学
技术研发日：.12.02
技术公布日：.02.28
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