微生物限度,microbial limit
1)microbial limit微生物限度
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microbial limit微生物限度检查
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4)microbial limit tests微生物限度检查
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5)limitation standard in microbe微生物限度标准
6)microbiological test微生物限度检验
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延伸阅读
微生物限度检查法【通用名称】微生物限度检查法【其他名称】微生物限度检查法 附录ⅩⅢ C. 微生物限度检查法 微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检 查方法。包括染菌量及控制菌的检查。 供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量(2个以上最小包装单位)的3倍量。 检查的全过程,均应严格遵守无菌操作,严防再污染。 除另有规定外,本检查法中细菌培养温度为30~35℃,霉菌、酵母菌培养温度为25 ~28℃,控制菌培养温度为36℃±1℃ 。 检验结果的报告以1g、1ml或10cm为单位。 培养基及其制备方法 除另有规定外,培养基制备的灭菌条件为121℃20分钟。 1 、营养琼脂培养基与营养肉汤培养基 见无菌检查法(附录ⅩⅢ B) 2 、玫瑰红钠琼脂培养基 胨 5g 玫瑰红钠 0.0133g 葡萄糖 10g 琼脂 15~20g 磷酸二氢钾 1g 水 1000ml 硫酸镁 0.5g 除葡萄糖、玫瑰红钠外,取上述成分,混合,加热溶化后,滤过,加入葡萄糖、玫瑰 红钠,分装,灭菌。 3 、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD) 胨 10g 琼脂 15~20g 酵母浸出粉 5g 水 1000ml 葡萄糖 20g 除葡萄糖外,取上述成分,混合,加热溶化后,滤过,加入葡萄糖,分装,灭菌。 4 、胆盐乳糖培养基(BL) 胨 20g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5g 牛胆盐(或去氧胆酸钠0.5g) 2g 氯化钠 5g 水 1000ml 磷酸氢二钾 4.0g 除乳糖、牛胆盐外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2, 煮沸,滤清,加入乳糖、牛胆盐,分装,灭菌。 5 、曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB) 营养琼脂培养基 100ml 曙红钠指示液 2ml 20%乳糖溶液 5ml 亚甲蓝指示液 1.3~1.6ml 取营养琼脂培养基,加热溶化后,冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其它3 种溶液, 摇匀,倾注平皿。 6 、麦康凯琼脂培养基(MacC) 胨 20g 1%中性红指示液 3ml 乳糖 10g 琼脂 15~20g 牛胆盐 5g 水 1000ml 氯化钠 5g 除乳糖、指示液、牛胆盐及琼脂外、取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使 灭菌后为7.2±0.2,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌, 冷至约60℃,倾注平皿。 7、4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide,MUG)培养基 胨 10g 磷酸二氢钾 0.9g 硫酸铵 5g 磷酸氢二钠(无水) 6.2g 硫酸锰 0.5mg 亚硫酸钠 40mg 硫酸锌 0.5mg 去氧胆酸钠 1g 硫酸镁 0.1g MUG 75mg 氯化钠 10g 水 1000ml 氯化钙 50mg 除MUG外,各成分溶解于1000ml水中,调节PH值使灭菌后为7.3±0.1,加入MUG,溶 解后,每管分装5ml,115℃灭菌20分钟。 8 、三糖铁琼脂培养基(TSI) 胨 20g 硫酸亚铁 0.2g 牛肉浸出粉 5g 硫代硫酸钠 0.2g 乳糖 10g 0.2%酚磺酞指示液 12.5ml 蔗糖 10g 琼脂 12~15g 葡萄糖 1g 水 1000ml 氯化钠 5g 除三糖、指示液、琼脂外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3 ±0.1,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,制成高底层(2~ 3cm)短斜面。 9 、四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB) 胨 5g 硫代硫酸钠 30g 牛胆盐 1g 水 1000ml 硫酸钙 10g 取上述成分,混合,微温使溶解,灭菌。 临用前,取上述培养基,每10ml加入碘溶液(取碘6g与碘化钾5g,溶于20ml水中)0.2ml 和亮绿试液0.1ml ,混匀。 10 、沙门、志贺菌属琼脂培养基(SS) 胨 5g 硫代硫酸钠 8.5g 牛肉浸出粉 5g 中性红指示液 2.5ml 乳糖 10g 亮绿试液 0.33ml 牛胆盐 8.5g 琼脂 20g 枸橼酸钠 8.5g 水 1000ml 枸橼酸铁铵 1g 除乳糖、指示液、琼脂外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.2 ±0.1,滤过,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,灭菌,冷至60℃,倾注 平皿。 11、胆盐硫乳琼脂培养基(DHL) 胨 20g 枸橼酸钠 1g 牛肉浸出粉 3g 枸橼酸铁铵 1g 乳糖 10g 中性红指示液 3ml 蔗糖 10g 琼脂 18~20g 去氧胆酸钠 1g 水 1000ml 硫代硫酸钠 2.3g 除糖、指示液及琼脂外,取上述成分,混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1, 加入琼脂,加热溶化后,再加入其余成分,摇匀,冷至60℃,倾注平皿。 12、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 胨 10g 溴化十六烷基三甲铵 0.3g 牛肉浸出粉 3g 琼脂 15~20g 氯化钠 5g 水 1000ml 除琼脂外,取上述成分,混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1,加入琼脂, 加热溶化后,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。 13、亚碲酸盐肉汤培养基 临用前,取灭菌的营养肉汤培养基,每100ml中加入新配制的1%亚碲酸钠(钾)试液0.2ml, 混匀,即得。 14、卵黄氯化钠琼脂培养基 胨 6g 10%氯化钠卵黄液 100ml 牛肉浸出粉 1.8g 琼脂 23g 氯化钠 30g 水 650ml 除10%氯化钠卵黄液外,取上述成分混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.6±0.1,灭 菌,待冷至约60℃,以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液,充分振摇,倾注平皿。 10%氯化钠卵黄液的制备 取新鲜鸡蛋1个,以无菌操作取出卵黄,放入10%灭菌氯化钠 溶液100ml中,充分振摇,即得。 15、甘露醇氯化钠琼脂培养基 胨 10g 酚磺酞指示液 2.5ml 牛肉浸出粉 1g 琼脂 15~20g 甘露醇 10g 水 1000ml 氯化钠 75g 除甘露醇、指示液及琼脂外,取上述成分混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2, 加入琼脂,加热溶化后,滤过,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。 16、蛋白胨水培养基 胰蛋白胨 10g 水 1000ml 氯化钠 5g 取上述成分,混合,加热溶化,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,分装于小试管,灭菌。 17、磷酸盐葡萄糖胨水培养基 胨 7g 磷酸氢二钾 3.8g 葡萄糖 5g 水 1000ml 取上述成分,混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,分装于小试管,121℃, 灭菌15分钟。 18、枸橼酸盐培养基 氯化钠 5g 枸橼酸钠(无水) 2g 硫酸镁 0.2g 溴麝香草酚蓝指示液 20ml 磷酸氢二钾 1.0g 琼脂 15~20g 磷酸二氢铵 1g 水 1000ml 除指示液和琼脂外,取上述成分,混合,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为6.9±0.1,加 入琼脂,加热溶化,加入指示剂,混匀,分装于小试管,灭菌,置成斜面。 注:所用琼脂应不含游离糖,用前用水浸泡冲洗。 19、糖、醇发酵培养基 基础液 胨 10g 0.5%酸性品红指示液 10ml 糖、醇 0.5% (或溴麝香草酚蓝指示液6ml ) 氯化钠 5g 水 1000ml 取胨和氯化钠加入水中,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4,加入指示液,混匀,分装 每瓶100ml,121℃灭菌15分钟。 配制葡萄糖发酵培养基时,于100ml基础液加入0.5g葡萄糖,分装于含杜氏管(Durham)的 小试管中,121℃灭菌15分钟。配制其他糖、醇发酵培养基时,将各种糖、醇分别配成10%溶 液,与基础液同时于121℃灭菌15分钟。以无菌操作将5ml糖、醇溶液加入100ml基础液内,分装 于灭菌小试管中。 注:糖、醇溶液亦可采用薄膜过滤法除菌。 20、脲(尿素)琼脂培养基 胨 1g 0.2%酚磺酞指示液 6ml 葡萄糖 1g 20%无菌脲溶液 100ml 氯化钠 5g 琼脂 20g 磷酸二氢钾 2g 水 1000ml 除脲和琼脂外,取上述成分,混合,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,加入琼脂,加热溶化 并分装于锥型瓶,灭菌,冷至50~55℃,加入无菌脲溶液,混匀,分装于灭菌试管中,置成斜面。 21、氰化钾培养基 胨 3g 磷酸氢二钠 5.64g 氯化钠 5g 氰化钾试液 15ml 碳酸二氢钾 0.225g 水 1000ml 除氰化钾试液外,取上述成分,混合,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1,灭菌,冷却后,加入 氰化钾试液,分装于12mm×100mm灭菌试管内,每管4ml,立即用灭菌橡胶塞塞紧,置4℃保存。 同时,以不加氰化钾试液的培养基作为对照培养基,分装于灭菌试管中。 22、赖氨酸脱羧酶试验培养基 胨 5g 1.6%溴甲酚紫指示液 1ml 酵母浸出粉 3g L-赖氨酸(DL-赖氨酸) 0.5(1)g 葡萄糖 1g 水 1000ml 除赖氨酸外,取上述成分,混合,加热溶解后,加入L-赖氨酸(DL-赖氨酸),调节pH值使 灭菌后为6.8,同时以不加赖氨酸培养基作为对照。分装于灭菌的小试管内,每管2.5ml并滴加一 层液体石蜡,121℃灭菌10分钟。 23、绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基(PDP琼脂) 胨 20g 甘油 10ml 氯化镁(无水) 1.4g 琼脂 18~20g 硫酸钾(无水) 10g 水 1000ml 取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入甘油及 琼脂,加热溶化,混匀,分装于试管,灭菌,置成斜面。 24、明胶培养基 胨 5g 明胶 120g 牛肉浸出粉 3g 水 1000ml 取上述成分加入水中,浸泡约20分钟,随时搅拌,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1, 分装于小试管,灭菌。 25、硝酸盐胨水培养基 胨 10g 亚硝酸钠 0.5g 酵母浸出粉 3g 水 1000ml 硝酸钾 2g 取胨和酵母浸出粉加入水中,微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入硝酸钾和亚硝 酸钠溶解,混匀,分装于含杜氏管的小试管,灭菌。 试药 牛肉浸出粉 Beef extract powder 本品为米色粉末,在水中溶解。 牛胆盐 Ox bile salt 本品为淡黄色或黄棕色粉末,味苦而甜,具吸湿性,在水和醇中易溶。 玫瑰红钠(四氯四碘荧光素钠) Rose bengal [C20H2Cl4Na2O5=1017.6] 本品为棕红色粉末。在水中溶解,溶液呈紫色,无荧光;在硫酸中溶解,溶液为棕 色。 枸橼酸铁铵 Ammonium ferric citrate [C12H22FeN3O14=488.16] 本品为棕红色或绿色鳞片或粉末,易潮解,见光易还原成亚铁。在水中溶解,在醇 和醚中不溶。 胰蛋白胨 Tryptone 本品为米黄色粉末,在水中溶解。 液状石蜡 Paraffin liquid 本品为无色油状液体。在水和醇中不溶,能与醚、苯、三氯甲烷、二硫化碳和油类 相混溶。 DL-赖氨酸 DL-Lysine [C6H14N2O2=146.19] 本品为白色结晶,极易潮解。在水中溶解。 L-赖氨酸 L-Lysine [C6H14N2O2=146.19] 本品为白色针状结晶,在空气中易吸收二氧化碳。在水中易溶,在醇中微溶,在醚 中不溶。 酸性品红 Fuchsin acid [C20H17N3Na2O9S3=585.54] 本品为绿色有金属光泽的颗粒或深红色粉末。在水中溶解,在醇中不溶。 磷酸二氢铵 Ammonium dihydrogen phosphate [NH4H2PO4=115.03] 本品为无色结晶或白色结晶性粉末。在水中溶解,在乙醇中不溶。 试液 二盐酸二甲基对苯二胺试液 取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g,加水10ml,即得。需 新鲜少量配制,于冷处避光保存,如试液变成红褐色,不可使用。 无菌对氨基苯甲酸试液 取对氨基苯甲酸0.1g,加入含10ml水的带塞试管中,121℃ 灭菌20分钟。 亚碲酸钠(钾)试液 取亚碲酸钠(钾)0.1g,加新鲜煮沸后冷至50℃的水10ml使 溶解。 玫瑰红钠试液 取玫瑰红钠试液0.1g,加水使溶解成75ml。 无菌枸橼酸钠-氯化钠试液 取枸橼酸钠0.5g,加0.9%氯化钠溶液10ml,121℃灭 菌20分钟。 草酸铵试液 取草酸铵1g,加水使溶解成100ml。 亮绿试液 取亮绿0.1g,加水100ml使溶解。 氢氧化钾试液 取氢氧化钾40g,加水溶解使成100ml。 盐酸试液 取盐酸8.4ml,加水稀释成100ml。 α-萘酚乙醇试液 取α-萘酚6.0g,加无水乙醇溶解使成100ml。 氰化钾试液 取氰化钾0.5g,加水溶解使成100ml。 氯化三苯四氮唑试液 取氯化三苯四氮唑0.1g,加水溶解使成10ml。 靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5.0g,加入戊醇(或丁醇)75ml,充分振摇,使 完全溶解后,再取浓盐酸25ml徐徐滴入,边加边振摇,以免骤热导致溶液色泽变深,或 取对二甲氨基苯甲醛1.0g,加入95%乙醇95ml,充分振摇,使完全溶解后,取浓盐酸20ml 徐徐滴入。 稀释剂 0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,121℃灭菌20分钟。 无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液 取1ml聚山梨酯80,加0.9%氯化钠溶液使成100ml,121 ℃灭菌20分钟。 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g,加水稀释至1000 ml,121℃灭菌20分钟。 指示液 中性红指示液 取中性红1.0g,研细,加95%乙醇60ml使溶解,再加水至100ml。 变色范围 pH6.8~8.0(红→黄)。 甲基红指示液 取甲基红0.1g,加95%乙醇300ml,使溶解后,加水至500ml,即得。 亚甲蓝指示液 取亚甲蓝0.5g,加水溶解使成100ml。 酚磺酞指示液 取亚甲蓝0.5g,加1mol/L氢氧化钠溶液2.82ml,使溶解,再加水至100ml。 变色范围 PH6.8~8.4(黄→红)。 溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1.6g,加95%乙醇溶解使成100ml。 变色范围 pH5.2~6.8(黄→紫)。 溴麝香草酚蓝指示液 取溴麝香草酚蓝0.4g,加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解,再加 水至100ml。 变色范围 pH6.0~7.6(黄→蓝)。 酸性品红指示液 取酸性品红0.5g,加水100ml使溶解,再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液 16ml,每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第2滴,直至溶液呈草黄色;于沸水内保持15分钟, 再静置2小时,滤过,即得。 变色范围 pH 6.0~7.4(黄→红)。 曙红钠指示液 取曙红钠2.0g,加水溶解使成100ml。 供试品的检验量 每批供试品检验量一般为10g 或10ml 。化学膜剂为100cm,贵重的或微量包装的供试 品检验量可以酌减,但口服药品不得少于3g,外用药品不得少于5g。 供试品须取自2 个以上的包装单位,大蜜丸、膜剂除须取自2 个以上的包装单位外,应 取自4 丸(片)以上样品。 供试液的制备 按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。 1 、液体供试品 取供试品10ml,加入稀释剂90ml中,混匀,作为供试液。油剂可加适 量聚山梨酯80;气雾剂以适宜方法使抛射剂导出后,加入适量稀释剂,混匀,吸取相当于10g 或10ml供试品,再稀释成100ml作为供试液;合剂(系指含王浆或蜂蜜者,下同)与滴眼剂可 用供试品作为供试液。 2 、固体、半固体或黏稠液供试品 称取供试品10g,置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中,用 匀浆仪或其他适宜方法,混匀后,作为供试液。在制备过程中,必要时可加适量聚山梨酯80, 并适当加温,但不应超过45℃。 (1)非水溶性供试品 取供试品5g(5ml),加入含溶化的无菌司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、 聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化 钠溶液约80ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为供试液(1:20)。 (2)不溶于水的膜剂供试品 取规定量,剪碎,加稀释剂100ml(必要时可增加稀释剂),浸 泡,振摇,作为供试液。 (3)肠溶胶囊(片)供试品 称取供试品10g,置含无菌磷酸盐缓冲液(pH6.8)100ml的锥形瓶 内,于45℃水浴中,保温,振摇,使溶解,作为供试液。 3、含抑菌成分供试品 供试品如干扰控制菌检验,按以下方法处理后,依法检查。 (1) 稀释法 将供试液种入较大量的培养基中,使该供试液稀释至不具抑菌作用的 浓度。 (2) 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液,离心(每分钟3000转)30分钟,弃去上清 液,留底部集菌液约2ml ,再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣,可先离心(每 分钟500转)5分钟,取全部上层液,再行集菌处理。 (3) 薄膜过滤法 取规定量的供试液,置稀释剂100ml中,摇匀,以无菌操作加入装 有直径约50mm、孔径不大于0.45μm±0.02μm微孔滤膜的过滤器内,减压抽干后,用稀 释剂冲洗滤膜3次,每次50~100ml,取出滤膜备检。 (4) 中和法 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品,可用相应的试剂钝化活性因 子,中和毒性后制成供试液。 对照用菌液 控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验。对照菌株为大肠杆菌[CMCC(B)44 102]、 沙门菌〔CMCC(B)50 094〕、铜绿假单胞〔CMCC(B)10 104〕及金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003〕。 取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至营养肉汤培养基内, 培养18~20小时后,稀释至1:10。 对照菌的加入量为50~100 个。 检查法 1 、细菌、霉菌与酵母菌计数 (1) 平皿菌落计数法 取均匀供试液,进一步稀释成1:10 、1:10等适宜的稀 释级。分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml,置直径约90mm的平皿中,再注入约45℃ 的培养基约15ml,混匀,待凝固后,倒置培养,每稀释级应作2~3个平皿。 营养琼脂培养基用于细菌计数,玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下, 前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数,后者同时点计细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼 脂培养基用于酵母菌计数。合剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养 基分别测定霉菌、酵母菌菌落数,合并计数。液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计 霉菌菌落数及酵母菌菌落数。 菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml,置4个无菌平皿中,分别按细 菌、霉菌计数用的培养基制备平板,培养,检查,不得长菌。 细菌培养时间为48小时,分别在24小时及48小时点计菌落数,一般以48小时菌落数为 准,霉菌、酵母培养时间为72小时,分别在48小时及72小时点计菌落数,一般以72小时 菌落数为准。菌落如蔓延生长成片,不宜计数。 点计后,计算各稀释级的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数。 菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在30~300之间的稀释级,霉菌宜选取平均菌 落数在30~100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30~300(30~ 100)之间时,将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告;如同时有2个稀释级在30~300(30 ~100)之间时,按下式计算两级比值。 高稀释级的平均菌落数×稀释倍数 比值=──────────────── 低稀释级的平均菌落数×稀释倍数 当比值≤2时,以两稀释级的均值报告,当比值>2时,以低稀释级的平均菌落数乘 以稀释倍数报告;如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30~300之间时,以后2个稀释级 计算级间比值报告;如各稀释级的平均菌落数均不在30~300之间,以最接近30或300的 稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告;如各稀释级平均菌落数均在300(100)以上,按最 高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告;如各稀释级平均菌落数均小于30时,一般按最 低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。如当1:10(或1:100 )稀释级平均菌落数等于 或大于原液(或1:10)稀释级时,应以培养基稀释法测定,按测定结果报告菌数。 (2) 培养基稀释法 取供试液(原液或1:10、1:100供试液)3份,每份各1ml,分别 注入5个平皿内(每皿各0.2ml)。每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml,混匀,凝固后 ,倒置培养,计数。每1ml注入的5个平板的菌落数之和,即为每1ml的菌落数,共得3组数 据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。 如各稀释级平板均无菌落生长,或仅最低稀释级平均菌落数小于1时,则报告菌数为 小于10个。 2 、控制菌检查 除另有规定外,取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml 、10cm), 直接或处理后接种,经增菌、分离培养后,进行革兰染色、生化试验与血清凝集试验等 项检查。 (1) 大肠杆菌(Escherichia coli) 取胆盐乳糖培养基3份,每份100ml,2份分别加 入规定量的供试液,其中1份加入对照菌50~100个作阳性对照,第3份加入与供试液等量 的稀释液作阴性对照。培养18~24小时(必要可延至48小时)。阴性对照应无菌生长。 取上述3份的培养物各0.2ml,分别接种至5mlMUG培养基管内培养,分别于5小时与24小时 时,取未接种的MUG培养基管作本底对照,将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现 荧光,MUG阳性。供试液的MUG管呈现荧光,MUG阳性;无荧光,MUG阴性。然后加数滴靛基 质试液于MUG管内,液面呈玫瑰红色为阳性,呈试剂本色为阴性。 当阴性对照呈阴性,阳性对照正常生长,供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明,并证明 无菌生长,判未检出大肠杆菌。供试液MUG阳性,靛基质阳性,判检出大肠杆菌;MUG阴性, 靛基质阴性,判未检出大肠杆菌。 如MUG阳性、靛基质阴性,或MUG阴性、靛基质阳性,均应取供试液胆盐乳糖培养基 培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养18~24小时,如上述供试液 培养物的分离平板无菌落生长,判未检出大肠杆菌。或有菌落生长,应挑选2~3可疑菌 落作靛基质试验(Ⅰ)、甲基红试验(M)、乙酰甲基甲醇生成试验(V-P)、枸橼酸盐利 用试验(C)及革兰染色、镜检,按表1规定判断结果。 靛基质试验(Ⅰ) 取可疑菌落或斜面培养物,接种于蛋白胨水培养基中,培养24小 时,沿管壁加入靛基质试液数滴,液面呈玫瑰红色为阳性,呈试剂本色为阴性。 甲基红试验(M) 取可疑菌落或斜面培养物,接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中, 培养48小时±2小时,于管内加入甲基红指示液数滴,立即观察,呈鲜红色或橘红色为阳 性,呈黄色为阴性。 乙酰甲基甲醇生成试验(V-P ) 取可疑菌落或斜面培养物,接种于磷酸盐葡萄糖 胨水培养基中,培养48小时±2小时,于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml,混匀, 再加40%氢氧化钾溶液0.4ml,充分振摇,在4小时内出现红色为阳性,无红色反应为阴 性。 枸橼酸盐利用试验(C) 取可疑菌落或斜面培养物,接种于枸橼酸盐培养基的斜面 上,一般培养48~72小时,培养基斜面有菌落生长,培养基由绿色变为蓝色时为阳性,培 养基颜色无改变为阴性。 结果判断见表1。对与MUG-1反应不符的可疑菌株(见注①、②),应重新分离培养, 再作生化试验证实。 表1 MUG的结果判断 ─────┬────────┬───────┬───────── MUG-1 │曙红亚甲蓝琼脂 │ IMVic │ 结 果 ─────┼────────┼───────┼───────── + + │ │ │ 检出大肠杆菌 - - │ │ │ 未检出大肠杆菌 + - │ 无菌生长 │ │ 未检出大肠杆菌 + - │ 有菌生长 │ - + - - ① │ 检出大肠杆菌③ - + │ 有菌生长 │ + + - - ② │ 检出大肠杆菌③ ─────┴────────┴───────┴───────── 注:①、②如①出现+ + - -或②出现阶段- + - -,均应重新分离菌株,再作MUG-Ⅰ和 IMVic试验。 ③革兰阴性杆菌。 (2) 沙门菌(Salmonella apecies) 取营养肉汤培养基3份,每份100ml,2份分别加 入规定量的供试液,其中1份加入对照菌液作阳性对照,第3份加入与供试液等量的稀释 液作阴性对照。培养18~24小时,阴性对照应无菌生长。取其余2份培养物各1ml,分别 接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10ml中,培养18~24小时。分别划线接种于胆盐硫乳琼脂 (或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上, 培养18~24小时或延至40~48小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时,供试品的平板 无菌落生长,或有菌落但不同于表2所列特征时,可判为未检出沙门菌。 如供试品平板生长的菌落特征有与表2所列菌落形态特征相符或疑似者,均应挑选2 ~3个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养基斜面上,阳性对照同时接种该培养基,培养18~ 24小时后,阳性对照的斜面应为红色,底层为黄色,硫化氢阳性,而供试品的疑似菌斜 面未见红色、底层未见黄色,可判为未检出沙门菌。否则,应继续做以下试验。 表2 沙门菌菌落形态特征 ───────┬──────────────────────────── 培 养 基 │ 菌 落 形 态 ───────┼──────────────────────────── 胆盐硫乳琼脂 │无色至浅橙色,半透明,菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色 ───────┼──────────────────────────── 沙门、志贺 │无色至淡红色,半透明或不透明,菌落中心有时带黑褐色 菌属琼脂 │ ───────┼──────────────────────────── 曙红亚甲蓝琼脂│无色至浅橙色,透明或半透明,光滑湿润的圆形菌落 ───────┼──────────────────────────── 麦康凯琼脂 │无色至浅橙色,透明或半透明,菌落中心有时为暗色 ───────┴──────────────────────────── 靛基质试验 照大肠杆菌项下操作并判断结果。 脲酶试验 取疑似菌斜面培养物接种于脲琼脂培养基斜面,培养24小时,斜面变为 红色为阳性,不变色为阴性。 氰化钾试验 取培养20~24小时的疑似菌株营养肉汤培养液,分别用白金耳沾取1 环,接种至对照培养基及氰化钾培养基,立即以橡胶塞塞紧,培养24~48小时,对照管 应有菌生长,试验管有菌生长者为阳性,无菌生长为阴性。 赖氨酸脱羧酶试验 取疑似菌斜面培养物分别接种于赖氨酸脱羧酶培养基及对照培 养基,培养24~48小时,对照管应为黄色,试验管呈紫色为阳性,呈黄色为阴性。 动力检查 取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中,培养24小时, 细菌沿穿刺外周扩散生长,为动力阳性,否则为阴性。阴性培养物,应在室温保留2~3 天后,再判断。 血清凝集试验 在洁净载玻片一端,以白金耳沾取沙门菌属A~F“0” 多价血清2 ~3环,再取斜面上部的培养物少许,与血清混合,将玻片前后侧动,如出现凝集现象, 应以0.9%氯化钠溶液与同株培养物作对照试验,无凝集现象时判为血清凝集阳性。时有 反应迟缓,需将玻片与湿棉球置平皿内,约过20分钟,再观察。仍未出现凝集时,应取 斜面培养物,置含少量0.9%氯化钠溶液的试管中,制成浓菌悬液,在100℃水浴中保温 30分钟,待冷,再作凝集试验。如出现凝集,应判为阳性,否则为阴性。 上述各项试验反应,一般应为硫化氢阳性(或阴性),靛基质阴性,脲酶阴性,氰化 钾阴性,赖氨酸脱羧酶阳性,动力阳性,A~F“0” 多价血清凝集试验阳性。各鉴定结 果按表3判定。 表3 沙门菌检查结果判定 ──┬─────────────────┬────┬───────── 序│ 血清凝集试验 │ │ │ (A~F“0” 血清) │ │ ├──┬───────┬──────┤生化试验│ 结 果 │凝集│ 100℃30分钟 │0.9%氯化钠 │ │ 号│反应│ 凝集反应 │溶液对照 │ │ ──┼──┼───────┼──────┼────┼───────── 1 │阳性│ │ 阴 性 │ 符 合│检出沙门菌 2 │阴性│ 阳 性 │ 阴 性 │ 符 合│检出沙门菌 3 │阴性│ 阴 性 │ │ 不符合│未检出沙门菌 ──┴──┴───────┴──────┴────┴───────── 上述各项试验任何一项不符合或有可疑反应的培养物,均应进一步鉴定后作出结论。 (3) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 取胆盐乳糖培养基3份,每份100ml, 2份分别加入规定量的供试液,其中1份加入对照菌液作为阳性对照,第3份加入与供试液 等量的稀释液作阴性对照。培养18~24小时,阴性对照应无菌生长,其余2份培养液划线 接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上,培养18~24小时。当阳性对照的平板呈 现阳性菌落时,供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长,可判未检出铜绿假单胞菌。 铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润,灰白色,周围时有 蓝绿色素扩散。如生长菌落具有上述特征或疑似者,应挑选2~3个菌落,分别接种于营 养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时,取培养物革兰染色,并做氧化酶试验。 氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养 物涂于滤纸片上,再滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液,在30秒内呈粉红色逐 渐变为紫红色为氧化酶试验阳性。否则为阴性。 如证实为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性,均可判为未检出铜绿假单胞菌。 否则,应进行绿脓菌素试验。 绿脓菌素(Pyocyanin) 试验 取上述琼脂培养物,接种于绿脓菌素测定用培养基斜 面上,培养24小时后,在试管内加氯仿3~5ml,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将氯 仿移至另一试管中,加入1mol/L盐酸试液约1ml,振摇后,静置片刻,如在盐酸溶液层内 出现粉红色,即为绿脓菌素阳性。试验同时应作阴性对照。 当阴性对照试验呈阴性时,并为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素阳性, 可判检出铜绿假单胞菌。 绿脓菌素阴性的培养物,应继续做以下试验。 硝酸盐还原产气试验 取营养琼脂培养基斜面培养物,接种于硝酸盐胨水培养基中, 培养24小时,如在培养基的杜氏管中有气体产生,即为阳性。 42℃生长试验 取营养琼脂培养基斜面培养物于0.9%无菌氯化钠溶液中,制成菌悬 液,再将菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面,立即置41℃±1℃水浴中培养24~48小时, 有菌苔生长者为阳性,否则为阴性。 明胶液化试验 以接种针沾取营养琼脂培养基斜面培养物,穿刺于明胶培养基内, 培养24小时,取出置冰箱内10~30分钟。如培养基仍呈溶液状,为阳性。 当为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性,绿脓菌素试验阴性,其硝酸盐还原产气试验、 42℃生长试验及明胶液化试验均为阳性时,应判检出铜绿假单胞菌。 (4) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取亚碲酸钠肉汤(或营养肉汤) 培养基3份,每份100ml,2份分别加入规定量的供试液,其中1份加入对照菌液作为阳性 对照,第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。均培养18~24小时(必要时可延至 48小时)。阴性对照应无菌生长。取其余2份培养液划线接种于卵黄高盐琼脂培养基平板 或甘露醇高盐琼脂培养基平板,培养24~72小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时, 供试品的平板如无菌落生长,或有菌落但不同于表4所列特征,可判未检出金黄色葡萄球 菌。 表4 金黄色葡萄球菌菌落形态特征 ─────┬───────────────── 培养基 │ 菌 落 形 态 ─────┼───────────────── 卵黄高盐 │金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有 琼脂 │卵磷脂分解的乳浊圈,菌落直径1~2mm ─────┼───────────────── 甘露醇高盐│金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有 琼脂 │黄色环,菌落直径0.7~1mm ─────┴───────────────── 如有菌落生长并与表4所列特征相符或疑似时,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养 琼脂培养基斜面上,培养18~24小时,取其培养物革兰染色,并作血浆凝固酶试验。 血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支,各加入血浆①-无菌水(1:1)0.5ml,1支加入 被检菌株的营养肉汤培养液(或浓菌悬液)0.5ml,1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培 养液或菌悬液0.5ml作阳性对照,另1支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性 对照。将3管同时培养。3小时后开始检查,以后适当时间逐次观察直至24小时。阴性对照 管的血浆流动自如,阳性对照管血浆凝固,试验管血浆凝固者为阳性;阳性对照管和阴性 对照管任何一管不符合要求时,应另制备血浆,重新试验。 当阴性对照和阳性对照符合要求,供试品的菌株为革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阳 性时,判定为检出金黄色葡萄球菌。 结果判断 细菌菌落数、霉菌(酵母菌)菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规定, 应判供试品合格;其中任何一项不符合该品种项下规定,应判供试品不合格。 细菌菌落数、霉菌(酵母菌)菌落数第一次测定超过该品种微生物限度项下规定时,应 从同一批号样品中随机抽样,复试2次,以3次结果平均值报告。 眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告,须以2次复试结果均不得长菌,方可判供 试品合格。 如营养琼脂培养基平板生长霉菌(酵母菌)菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板生长细 菌菌落数超过该品种微生物限度项下规定时,经复试2次,如3次结果平均值仍超过规定, 应判供试品不合格。 各类制剂检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再抽样复试,即应 判该供试品不合格。 ① 血浆的制备 以无菌注射器吸取灭菌的含5%枸橼酸钠的0.9%氯化钠溶液1ml, 用无菌操作采取家兔(或羊、人)血9ml,轻轻混匀数分钟。待血液不凝固时,徐徐放入 灭菌离心管中,离心,分离血浆,用灭菌吸管取血浆移至灭菌试管中,置冰箱内备用。 临用前必须用已知血浆凝固酶试验阳性的金黄色葡萄球菌测试,证明血浆合格后,方可 用于试验。 表5 微生物限度标准 (单位:个/g或个/ml) ────────────┬────┬───────┬─────┬────────┬─── ─── 剂 型 │细菌数 │霉菌、酵母菌数│大肠杆菌 │金黄色葡萄球菌 │铜绿假 单胞菌 ────────────┼────┼───────┼─────┼────────┼─── ─── 丸剂 │ │ │ │ │ 不含原药材粉 │ 1000 │ 100 │ — │ │ 含原药材粉 │ 30000 │ 100 │ — │ │ 散剂 │ 30000 │ 100 │ — │ │ 口服兼外用 │ 30000 │ 100 │ — │ — │ — 阴道用 │ 100 │ 10 │ │ — │ — 颗粒剂 │ │ │ │ │ 不含原药材粉 │ 1000 │ 100 │ — │ │ 含原药材粉 │ 10000 │ 100 │ — │ │ 片剂 │ │ │ │ │ 不含原药材粉 │ 100 │ 100 │ — │ │ 含原药材粉 │ 10000 │ 100 │ — │ │ 锭剂 │ 10000 │ 100 │ — │ — │ — 口服兼外用 │ 10000 │ 100 │ — │ │ 煎膏剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 胶剂 │ 1000 │ 100 │ — │ │ 糖浆剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 合剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 滴丸剂 │ 1000 │ 100 │ — │ │ 胶囊剂 │ │ │ │ │ 不含原药材粉 │ 1000 │ 100 │ — │ │ 含原药材粉 │ 10000 │ 100 │ — │ │ 酒剂 │ 500 │ 100 │ — │ │ 外用 │ 500 │ 100 │ │ — │ — 酊剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 外用 │ 100 │ 100 │ │ — │ — 流浸膏剂与浸膏剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 软膏剂 │ 1000 │ 100 │ │ — │ — 用于烧伤、溃疡、创伤者│ 100 │ 10 │ │ — │ — 露剂 │ 100 │ 100 │ — │ │ 茶剂 │ │ │ — │ │ 不含糖 │ 10000 │ 100 │ │ │ 含糖 │ 1000 │ 100 │ │ │ 搽剂 │ 100 │ 100 │ │ │ 栓剂 │ 10000 │ 100 │ │ — │ — 用于溃疡、出血者 │ 100 │ 10 │ │ — │ — 滴鼻剂 │ 100 │ 10 │ — │ — │ — 滴眼剂 │ 100 │ — │ │ — │ — 气雾剂、喷雾剂 │ 100 │ 10 │ — │ — │ — ────────────┴────┴───────┴─────┴────────┴─── ──── 注:—表示每1g或每1ml不得检出。 说明 1.含动物及含脏器的制剂(包括提取物)还不得检出沙门菌。 2.用于创伤、溃疡、止血、深部组织及阴道的含原药材粉的制剂,还不得检出破伤风梭菌。 3.霉变、长螨者以不合格论。
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