在具备食用菌生产设备的单位或个人，均可自行进行北虫草母种的分离培养。先配制最常用的综合马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基。具体做法为：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升，煮沸20分钟，滤除渣取汁液于锅中。尔后加入20克琼脂溶化，再加入20克葡萄糖，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克。并搅拌均匀，并继续加热至琼脂完全熔化，最后补足水分至1000毫升。
培养基做好后，趁热分装试管。装量为试管长度的1/3～1/4。分装完后塞上棉塞，每7～10支捆成一捆，上包牛皮纸防潮并进行高压蒸气湿热灭菌（用1.05千克/厘米，121℃半小时），待压力降到0时，打开排气阀排出残留蒸气，取出试管及其他消毒物品，并趁热把试管摆成斜面，斜面长度为试管长度的1/3到1/2。
选择采集生长健壮，尚未散发孢子的北虫草，用清水轻轻冲洗外表至基本干净。用消毒刀片切取子实体上半部为2毫米左右见方小块，于75%酒精溶液中消毒2秒钟。再以0.1%升汞液消毒20～30秒，无菌水冲洗3次。置试管斜面培养基上20℃培养。也可取虫体，以0.1%升汞消毒1～3分钟，用无菌水冲洗虫体上残余升汞液后，用解剖刀在无菌条件下切去虫体外层。为防止虫体内细菌干扰，可用50微克/毫升的链霉素或青霉素浸沾虫体，然后切成绿豆大小组织放置斜面培养基上。在20℃温箱中培养。10天左右斜面上生成白色菌落，并有浅**色素产生则为北虫草菌丝体。但其性能是否可靠，还需将它们接种于米饭培养基上，在18～20℃进一步培养观察，纯化。选前期匍匐型菌丝量多，后期出草量多的菌种确定为母种。
如菌种生产经验不足或设备条件不具备，可向有关北虫草生产厂家或菌种生产、科研单位购买、引进。
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