本文为以 4 个兰科物种中 NB-ARC 结构域的序列信息作为输入，构建有根基因树。步骤参考文献 Genome- Wide Analysis of the Nucleotide Binding Site Leucine-Rich Repeat Genes of Four Orchids Revealed Extremely Low Numbers of Disease Resistance Genes，Front. Genet.，08 January 。
我们知道构建基因家族的有根基因树与基因家族的扩张和收缩分析需要物种树作为支持（详情参见：OrthoFinder 2.0 原理及所涉及的相关概念 ）。本文通过OrthoFinder 推断物种树。
OrthoFinder 虽然可以生成基因树，但是组成基因树的基因必须来自于 OrthoFinder 通过 MCL 算法聚类出的 Orthogroup。如果待研究的基因家族基因无法被聚在 1 个 Orthogroup 中，则无法通过 Orthogroup 将所有基因家族成员绘制在 1 个基因树中。为了提高分析的灵活性，本文使用IQtree 推断无根基因树，然后利用Notung 调和无根基因树与有根物种树，得到有根基因树并完成基因家族的扩张和收缩分析。最后利用 iTOL 对基因树进行可视化呈现。
一、使用数据
构建物种树使用的是 4 个兰科物种的全部蛋白质序列信息。构建基因树使用的是 4 个兰科物种蛋白组中 NB-ARC 结构域序列信息（结构域长度 ∈ [ 75% mean-length，125% mean-length ]）。二、分析流程
1. 使用 OrthoFinder 推断有根物种树
有关 OrthoFinder 的介绍详见 OrthoFinder 2.0 原理及所涉及的相关概念使用 orthofinder 根据 4 个兰科物种的蛋白序列，构建物种树。
$ orthofinder -f protein_fasta/ -t 50 -a 50-t number_of_threads：多序列比对及建树等所调用的 CPU 数-a number_of_orthofinder_threads ：多序列比对及建树外其他操作所调用的 CPU 数
OrthoFinder 将文件夹 protein_fasta 内所有以 .fa、.faa、.fasta、.fas、.pep 结尾的文件作为输入，读取文件内的蛋白序列。有根物种树结果如下图（图 1）所示（通过 megax 查看）
与参考文献中物种树结构一致（图 2），说明了 OrthoFinder 结果的准确性。由于 OrthoFinder 无需外群即可生根，为了判断无外群生根的准确性，本实验以 Amborellla trichopoda 作为外群进行建树，命令如下：
$ orthofinder -b protein_fasta/OrthoFinder/Results_Jan11/WorkingDirectory/ -f Atrichopoda/
-b <dir1> -f <dir2> 中 <dir1> 是指原先分析输出中的 WorkingDirectory 文件夹路径，<dir2> 是指新添物种的蛋白序列文件夹路径。命令表示在原先分析 <dir1> 的基础上添加 <dir2> 中物种的蛋白序列进行分析。这种做法相比从头分析省去了原先蛋白序列间比对的时间，OrthoFinder 将只进行新添序列间及新添序列与原序列间的比对。物种树结果如下：
可以发现，不加外群和加外群物种树的拓扑结构是一致的，验证了 OrthoFinder 不加外群构建有根物种树的准确性。
Amborella trichopoda，无油樟，双子叶植物，其被认为是被子植物中最早分化出来的一支，和其他几乎所有的被子植物都没有明显的亲缘关系，常被用作基因分析的外群。Amborella 的基因组数据下载自 JGI phytozome
https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Atrichopoda
https://data.jgi.doe.gov/refine-download/phytozome?organism=Atrichopoda&expanded=291。
由于 OrthoFinder 不支持输入用户定义的 Orthogroup，而 4 个物种的 NB-ARC domain 会被 OrthoFinder 分割为多个 Orthogroup 并分别构建基因树，无法将 4 个物种的 NB-ARC 构建在 1 棵基因树中。这里使用 IQtree 来推断基因树结构。
2. 使用 IQtree 推断无根基因树
有关 IQtree、MUSCLE 的介绍详见 MUSCLE、IQtree 软件及使用简介使用 MUSCLE 对 NB-ARC domain 蛋白序列进行多序列比对。
muscle -in NB-ARC.domain.fasta -out NB-ARC.domain.afa -maxiters 2-in 输入文件 -out 输出文件名，输出文件默认为 Fasta 格式-maxiters 最大迭代次数
将多序列比对的结果作为 IQtree 的输入，推断无根基因树结构。
$ iqtree -s NB-ARC.domain.afa -nt 50 -m JTT+F+R10 -n 2 -alrt 1000-s 输入文件-nt 线程数-m 指定使用模型：JTT+F+R10-n 指定进化树迭代次数：2-alrt 使用SH-aLRT检验并指定重复抽样次数：1000
252 个 NB-ARC domian 蛋白序列信息中 6 个蛋白没有通过 IQtree 的 chi2 检验，最终构建出包含 246 个蛋白的无根基因树。
3. 使用 Notung 根据有根物种树为无根基因树生根且推断基因复制、转移、丢失事件
Notung 输入：有根物种树、无根基因树
物种树必须包含基因树中所有基因的物种，额外的物种将被 Notung 忽略。输入的基因树中的每个基因需要包含物种信息（格式：gene_species）。Notung 以 “_” 作为分隔符，基因名中最后一个 “_” 后内容作为物种名。如 Notung 认为 XP_020599319.1_Phalaenopsis_equestris 的基因名为 XP_020599319.1_Phalaenopsis，物种名为 equestris。所以如果物种名中包含 “_” 需替换为 “-” 或其他字符。
在 Notung 中导入基因树、物种树后，通过Rooting Mode将无根基因树转化为有根基因树。Rooting Mode 根据有根物种树为每个边计算 DTL 分数（DTL 分数越小的越适合做根），Notung 会高亮（红色）最小值及附近 [(max-min) × 5% ] 的边。用户通过鼠标点击确定选择那个边作为根。将生根后的基因树以NEWICK格式导出。
Notung 的 Reconciliation Mode 功能的输入是有根基因树，通过比较基因树和物种树推断基因复制、转移、丢失事件。Notung 的 Rooting Mode 功能的输入是无根基因树，通过比较基因树和物种树推断最可能的生根边，根据用户选择的根推断基因复制、转移、丢失事件。本文使用的是 Rooting Mode 功能。
将有根物种树、无根基因树导入后发现 Notung 会计算出许多适合的生根位点（下图红线）。在没有外群的情况下，难以确定适合的生根位点。
为此，本文原先的数据集中加入外群（Amborella trichopoda）后重新进行 MUSCLE、IQtree 分析。Notung 计算出适合的生根位点如下图所示。可以发现，凭借外群能方便寻找适合的生根位点。从 Notung 的底边栏可以看到 Notung 推断 NB-ARC 发生了 254 次基因复制事件，76 次基因丢失事件。将生根后的基因树以NEWICK格式导出。
4. 利用 iTOL 在线工具绘制基因树图
iTOL：https://itol.embl.de/upload.cgi
将 Notung 生成的有根基因树文件作为输入，提交至 iTOL。图中
土黄：Amborella trichopoda（外群）红色：Dendrobium catenatum紫色：Phalaenopsis equestris青色：Apostasia shenzhenica绿色：Gastrodia_elata
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