本发明涉及分子荧光探针技术领域，特别是一种基于氧杂蒽染料检测粘度的大斯托克斯位移深红荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来，得益于荧光成像技术的发展，荧光探针技术因其具有高选择性与灵敏度、快速响应等优点，可以在细胞及细胞器水平实现非侵入性、高时空分辨可视化检测，因此，在检测和监测生物活性分子领域显示出巨大的应用潜力。与发射光谱位于紫外-可见光区的荧光探针相比，发射光谱为位于深红区的荧光探针显示出更好的组织穿透性和更小的光损伤，并且可以有效避免生物组织背景荧光产生的干扰，受到研究人员的青睐。此外，具有大斯托克斯位移的荧光探针可以有效避免自淬灭和激发光谱产生的干扰。
细胞内粘度是控制物质传递、信号传导以及生物大分子之间相互作用的关键影响因素。细胞内各区域粘度高度不均匀，为了更好地监测细胞内粘度的局部变化，监测不同的细胞器内粘度显得尤其重要。例如，线粒体粘度异于正常水平，则会导致线粒体网络组织的变化和代谢物扩散速率，严重的甚至导致细胞损伤甚至凋亡。目前，报道的大多数粘度探针都具有较短的荧光发射波长和较窄的斯托克斯位移，并且大都基于花菁、半菁和bodipy结构设计合成，而基于氧杂蒽结构的粘度探针还未见报道。因此，开发基于氧杂蒽结构的大斯托克斯位移深红荧光探针用于荧光成像检测活细胞内粘度具有非常重要的科学意义和实用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对目前检测粘度荧光探针存在的问题，提供一种能够特异性检测体外及体内环境中粘度的大斯托克斯位移深红荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针能灵敏的检测溶液中的粘度，并且可以对细胞中粘度进行荧光成像检测。
本发明的技术方案：
本发明所设计、合成的基于氧杂蒽染料用于粘度检测的大斯托克斯位移深红荧光探针mxso，结构通式如下：
一种所述用于粘度检测的大斯托克斯位移深红荧光探针mxso的制备方法，制备流程如下所示：
具体制备步骤如下：
将9-甲基黄嘌呤加至4-甲砜基苯甲醛和哌啶的乙醇溶液中，然后于78℃反应12小时，反应结束后冷却至室温得到反应液。将上述反应液进行减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为50：1-2的二氯甲烷-甲醇混合液，得到具有深红发射的暗红色粉末探针mxso。所述9-甲基黄嘌呤、4-甲砜基苯甲醛和哌啶的摩尔比为5:5:1；所述9-甲基黄嘌呤与溶剂乙醇的重量比为1:19-20；所述4-甲砜基苯甲醛与溶剂乙醇的重量比为1:42-43；所述吡啶与乙醇的体积比为1:500。
具体基于氧杂蒽染料的大斯托克斯位移深红荧光探针mxso的应用如下：
运用大斯托克斯位移深红荧光探针mxso高灵敏性识别具有不同粘度的溶液，高粘度可以引起探针溶液显著的荧光增强，并且探针可以对细胞内粘度进行荧光成像检测。
本发明的优点和有益效果：
本发明设计并合成了一种基于氧杂蒽染料的用于粘度检测大斯托克斯位移深红荧光探针mxso。该探针合成过程简单且反应条件温和。所制备的探针具有高灵敏度，可以在较宽的ph范围内保持稳定，引起深红区荧光发射光谱的显著变化，从而实现对粘度的特异性检测。同时，该探针具有良好的细胞膜透性、低细胞毒性以及线粒体靶向定位功能，成功实现对人宫颈癌(hela)细胞中的粘度进行荧光成像检测。
附图说明
图1是荧光探针mxso的结构
图2是荧光探针mxso在不同粘度溶液中的荧光光谱
图3是荧光探针mxso对hela细胞内粘度的荧光成像图
具体实施方式
实施例1、探针mxso的制备路线如下：
具体制备步骤如下：
1)在室温搅拌、氩气保护下，将20μl哌啶加入含有4-甲砜基苯甲醛(168mg,1mmol)和9-甲基黄嘌呤(395mg,1mmol)的10ml无水乙醇溶液中，然后于78℃反应12小时，反应结束后冷却至室温得到反应液；
2)将上述反应液进行减压蒸馏浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为50：1-2的二氯甲烷-甲醇混合液，得到暗红色固体探针mxso，产率为67％；熔点：98-102℃。
1hnmr(cdcl3,400mhz,ppm)δ＝8.17(1h),8.11(1h),7.94(2h),7.84(1h),7.72(2h),7.30-7.28(2h),7.17-7.14(2h),6.85(1h),4.01(3h),3.71(4h),2.88(3h),1.37(6h)；13cnmr(cdcl3,100mhz,ppm)δ＝167.70,158.88,158.64,158.23,157.47,156.56,154.97,144.24,144.07,138.33,132.22,130.00,129.38,124.81,121.17,117.35,116.89,116.22,115.41,114.21,113.38,100.64,96.65,56.76,46.78,42.47,30.92,29.69,27.93.
探针mxso的荧光检测应用：
将探针配成浓度为5.0×10-3mol/l的dmf溶液，避光保存备用。检测方法如下：
1)探针mxso的灵敏性检测
分别利用不同比例的甘油和水配置粘度溶液，然后分别加入探针母液配置成1×10-5mol/l的待测液3ml，以500nm波长进行激发，测试各溶液荧光发射光谱。结果如图2所示，随着粘度增加探针发生显著的荧光增强。
2)探针mxso用于hela细胞内粘度荧光成像检测
先将10μm莫能菌素与hela细胞共同培养0.5h，然后加入1μm探针继续培养0.5h，用pbs缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行成像，采用559nm进行激发，收集576-662nm范围内荧光信号。成像结果如图3所示，在细胞内可以观察到显著的荧光发射信号，表明探针可以荧光成像检测细胞内粘度。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围，作为粘度荧光探针是本发明的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于粘度荧光探针，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种用于粘度检测的大斯托克斯位移深红荧光探针mxso，其特征在于，所述探针对粘度进行高灵敏性识别，引起位于深红区的荧光发射光谱的变化，结构通式如下所示：
2.一种权利要求1所述用于粘度检测的大斯托克斯位移深红荧光探针mxso的制备方法，其特征在于制备流程如下所示：
其步骤如下：
1)将9-甲基黄嘌呤加至4-甲砜基苯甲醛和哌啶的乙醇溶液中，然后于78℃反应12小时，反应结束后冷却至室温得到反应液；
2)将上述反应液进行减压蒸馏浓缩得到粗产品，粗产品用柱层析硅胶进行分离、提纯，所用洗脱剂为体积比为50：1-2的二氯甲烷-甲醇混合液，得到具有深红发射的暗红色粉末探针mxso。
3.根据权利要求2所述用于粘度检测的大斯托克斯位移深红荧光探针mxso的制备方法，其特征在于：所述9-甲基黄嘌呤、4-甲砜基苯甲醛和哌啶的摩尔比为5:5:1；所述9-甲基黄嘌呤与溶剂乙醇的重量比为1:19-20；所述4-甲砜基苯甲醛与溶剂乙醇的重量比为1:42-43；所述吡啶与乙醇的体积比为1:500。
4.权利要求1所述的用于粘度检测的大斯托克斯位移深红荧光探针mxso的应用，其特征在于，该探针用于检测溶液和细胞内的粘度。
技术总结
本发明提供一种用于粘度检测的大斯托克斯位移深红荧光探针MXSO及其制备方法和应用。是将9‑甲基黄嘌呤、4‑甲砜基苯甲醛和哌啶溶于乙醇中，反应后得到固体探针MXSO。该探针合成操作过程简单且反应条件温和。所制备的探针具有高灵敏度，可以在较宽的pH范围内保持稳定，引起深红荧光发射光谱的显著变化，从而实现对粘度的特异性检测。同时，细胞成像实验表明探针具有良好的细胞膜透性、低细胞毒性以及线粒体靶向定位功能，成功实现对人宫颈癌(HeLa)细胞中粘度的荧光成像检测。
技术研发人员：曾宪顺;公锦
受保护的技术使用者：天津理工大学
技术研发日：.09.24
技术公布日：.12.20
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