看点：lncRNA BLACAT2与WDR5蛋白相互作用，正调控VEGF-C表达的机制研究。
关键词：
LncRNA BLACAT2(bladder cancer–associated tran 2)：膀胱癌相关转录本2，在LN转移性膀胱癌中显著上调，可促进膀胱癌相关淋巴管生成和淋巴结转移。
WDR5（WD repeat-containing protein 5）：WD40蛋白家族成员，编码序列由333个氨基酸组成，肽链含有7个WD重复结构，不仅参与了脊椎动物的发育，还与MLL1蛋白、SET1蛋白等组成各种复合体，参与细胞内许多基因的转录激活，WDR5作为赖氨酸甲基转移酶复合物的组分之一，参与了组蛋白H3K4二甲基化和三甲基化修饰过程，在胚胎细胞自我更新过程、骨骼发育和乳腺癌细胞的转移以及膀胱癌细胞增殖过程中发挥着重要作用。
VEGF-C（Vascular endothelial growth factor C）：血管内皮生长因子C，是血小板衍生生长因子/血管内皮生长因子（PDGF/VEGF）家族中的一员。由位于4q34染色体上的人类VEGFC基因编码的一类蛋白。VEGF-C是淋巴管生成的重要因子，主要功能为增强淋巴管内皮细胞的趋化性，细胞增殖和淋巴管的增加，与其受体VEGFR-3结合，通过胞质内信号传递，导致细胞增殖。
RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀）：是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。
RNA-pull down：是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNA pull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，可通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用，也可通过质谱分析得到相关RNA结合蛋白。
结论：lncRNA BLACAT2与WDR5蛋白相互作用，正调控VEGF-C表达，促进膀胱癌相关淋巴管生成和淋巴结转移。
结果展示如下：
A：通过RNA-pull down实验从UM-UC-3膀胱癌细胞中调取与LncRNA BLACAT2结合的蛋白，蛋白产物经银染检测分析表明：与LncRNA BLACAT2 Antisense（反义链）组相比，LncRNA BLACAT2 sense（正义链）组RNA-pull down蛋白产物银染检测于35kDa到40kDa之间存在明显特异条带，MS质谱分析表明WDR5可与LncRNA BLACAT2正义链相互作用。
银染：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质，是银离子在碱性pH环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上显色的原理。
MS质谱：是一种鉴定技术，在有机分子的鉴定方面发挥非常重要的作用。它能快速而极为准确地测定生物大分子的分子量，可实现蛋白质的快速高灵敏度鉴别和测定，使蛋白质组研究从蛋白质鉴定深入到高级结构研究以及各种蛋白质之间的相互作用研究。
B：通过RNA-pull down实验分别从UM-UC-3膀胱癌细胞核提取物和体外纯化合成的WDR5蛋白中调取与LncRNA BLACAT2结合的蛋白，蛋白产物经Western blot实验分析表明：与LncRNA BLACAT2 Antisense（反义链）组相比，LncRNA BLACAT2 sense可直接与WDR5蛋白相互作用。
C：通过RIP实验分别从人膀胱移行癌细胞（UM-UC-3）和膀胱癌细胞（5637）中调取与WDR5蛋白互作的RNA，产物检测BLACAT2。QPCR结果分析表明：与阴性对照U1相比，WDR5可显著富集BLACAT2，即WDR5蛋白可与LncRNA BLACAT2相互作用，HOTTIP做为WDR5 RIP实验的阳性对照。
HOTTIP（HoxA transc ript at the distal tip）：HoxA基因簇末端转录本，定位于染色体7p15.2上，在乳腺癌、结直肠癌等多种癌症中异常表达。对HoxA基因簇5’区域基因(Hoxa13至Hoxa6)的表达具有调控功能，HOTTIP通过与WDR5结合募集MLL1复合物并对组蛋白进行H3K4me3修饰。
U1：snRNA，是指存在于真核细胞胞核中的一种富含尿氨酸（U）的具有酶活性的小分子RNA，其主要功能是剪接核内非均一性RNA，使其成为成熟RNA。
D：对LncRNA BLACAT2进行裁切截断，分别截断为1-600nt，601-1055nt，1-455nt，456-1055nt。通过RNA-pull down实验从UM-UC-3膀胱癌细胞中调取与截断LncRNA BLACAT2结合的蛋白，蛋白产物经Western blot实验分析表明：与LncRNA BLACAT2反义链相比，全长正义链、1-600nt和1-455nt的截断LncRNA BLACAT2均可与WDR5蛋白相互作用，而截断601-1055nt和截断456-1055nt的LncRNA BLACAT2则不能结合WDR5蛋白。由此可知，LncRNA BLACAT2与WDR5蛋白结合互作的核心区域位于1-455nt。
E：对LncRNA BLACAT2 1-455nt序列再进行裁切截断，分别截断为1-100nt，1-200nt，1-300nt，101-455nt，131-455nt，161-455nt，191-455nt，221-455nt。通过RNA-pull down实验从UM-UC-3膀胱癌细胞中调取与截断LncRNA BLACAT2结合的蛋白，蛋白产物经Western blot实验分析表明：在1-455nt截断LncRNA BLACAT2 RNA-pull down实验中，仅有1-455nt，1-200nt，1-300nt和101-455nt的截断LncRNA BLACAT2可显著结合WDR5蛋白，其余截断序列均不能结合WDR5蛋白，因此可知，LncRNA BLACAT2与WDR5蛋白结合互作的核心区域位于100-130nt。
F与G：在UM-UC-3细胞和5637细胞中，分别瞬转BLACAT2野生型质粒和BLACAT2突变型质粒（定点突变100-130nt位置），QPCR检测VEGF-C mRNA表达情况，ELISA检测VEGF-C蛋白表达情况。结果分析表明：过表达LncRNA BLACAT2的细胞株中VEGF-C的mRNA表达水平和蛋白表达水平显著高于对照组细胞，而定点突变100-130nt位置的BLACAT2对VEGF-C的表达几乎不影响。
H与I：在UM-UC-3细胞和5637细胞中，分别瞬转BLACAT2野生型质粒和BLACAT2突变型质粒（定点突变100-130nt位置），通过HLEC迁移实验和小管形成实验，结果表明：过表达LncRNA BLACAT2的细胞株中HLEC迁移和管形成显著上调，而定点突变100-130nt位置的BLACAT2则对HLEC迁移和管形成几乎不影响。
HLEC：人淋巴内皮细胞。
tube formation：小管形成实验，能模拟人体内毛细血管生成的过程，包括内皮细胞出芽增殖和毛细血管网结构形成等步骤，接近人体内血管生成的实际过程。内皮细胞在基质胶、纤维蛋白胶、胶原等基质上培养时能形成网状结构。用电子显微镜来分析小管问的紧密连接，从而定量血管生成情况。需要指出的是似乎所有的内皮细胞都能在细胞外基质上形成管状结构，有些非内皮细胞也能在基质胶上形成管腔结构。
材料来源：J Clin Invest.
Long noncoding RNA BLACAT2 promotes bladder cancer–associated lymphangiogenesis and lymphatic metastasis
Fig7. BLACAT2 directly binds to WDR5 protein and regulates VEGF-C expression.
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