基金项目：北京市朝阳区科技计划（CYSF172502）
膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是以关节的疼痛、僵硬肿胀，甚至功能丧失为临床表现的一种慢性退行性疾病，其危险因素包括老年、肥胖、创伤、过度使用及遗传易感性等。我国目前骨关节炎总患病率已达到27.18%，其中KOA的患病率约为18%，并且女性KOA患病率显著高于男性。该疾病为患者带来了极大的痛苦和不便，严重降低其生活质量，因此，防治KOA是社会必要的需求，具有重要的社会价值。大多数研究认为医用臭氧关节腔内注射治疗KOA疗效显著，且治疗时间为4周，但未有研究表明是否治疗时间越长，其治疗效果越好。目前，国内外文献中未见通过对臭氧治疗不同时间进行分组治疗KOA的研究。本实验通过拟用不同治疗疗程的医用臭氧关节腔内注射对KOA家兔进行干预，观察不同治疗时间医用臭氧关节腔内注射治疗KOA，对关节液中SOD及关节软骨的影响，探讨臭氧治疗时间与KOA疗效的关系。
方法
1. 实验动物及分组
30只健康新西兰实验家兔（普通级），体重2.0~2.5 kg。进入实验室后适应性喂养3天，单笼单兔喂养，保持室温23~25℃，相对湿度40%~60%，通风。利用抽签法将家兔随机分为正常组对照组(N)、模型组对照组(M)、2周臭氧治疗组(O3-2)、4周臭氧治疗组(O3-4)、6周臭氧治疗组(O3-6)，每组6只。
2. 实验仪器
臭氧治疗仪；兔子双足平衡支撑力测量仪；超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）试剂盒。
3. 实验方法
N组正常饲养，不做模型手术；M组、O3-2组、O3-4组及O3-6组采用经典Hulth改良法制作KOA模型：麻醉后，于兔左侧膝关节中内侧做长约1cm的纵行皮肤切口，摘除内侧半月板、切断内侧副韧带及前交叉韧带。术中避免损伤关节软骨面，术后连续三天抗生素抗感染治疗，术后一周开始驱赶动物活动30min，连续12周。3个月后O3-2组、O3-4组及O3-6组兔左膝关节腔内注射20μg/ml臭氧，每次2mL，每周1次，分别注射2周、4周及6周。
4. 取材
N组与M组3个月后麻醉药物过量处死家兔，O3-2组、O3-4组及O3-6组分别于末次治疗后3天处死。处死后，抽取1mL生理盐水注入家兔左膝关节腔，充分活动膝关节后抽取关节灌洗液，测定SOD OD值。再解剖左膝关节，首先观察软骨形态学变化，然后切开取股骨内侧髁软骨及软骨下骨，标本进行固定、脱钙、石蜡包埋及切片后，行HE及甲苯胺蓝(Toluidine blue, TB)染色，并且行Mankin"s评分。
5. 检测和评价兔膝关节功能变化
每次取材前观察并记录局部疼痛刺激反应、步态改变、关节活动度、关节肿胀程度。用“测定双足平衡设备”检测臭氧治疗前（即第一次注射臭氧前）与治疗后（即处死前）兔双侧后足分别承重情况。
6. 病理观察及Mankin"s评分
每份关节灌洗液稀释后，分别采用黄嘌呤氧化酶法测定 SOD OD 值，根据试剂盒提供的说明书进行操作。
肉眼观察关节软骨表面是否光滑，有无糜烂、溃疡及骨赘形成；HE染色观察软骨表面是否光滑，软骨细胞排列是否规则、软骨细胞数量变化、软骨表层纤维成分变化、潮线是否完整等；TB 染色观察ECM的着色深浅。使用Mankin"s评分评估软骨损伤情况，分数越高说明软骨损伤越重。
7. Elisa 法检测关节液 SOD 的表达
每份关节灌洗液稀释后，分别采用黄嘌呤氧化酶法测定 SOD OD 值，根据试剂盒提供的说明书进行操作。
8. 统计学分析
应用SPSS 22.0软件对数据进行处理并做统计分析，统计描述以均数±标准差(±SD) 表示，SOD OD值测量及Mankin"s评分采用单因素方差分析 (ANOVA) 检验，双足平衡支撑力测量组间比较采用ANOVA检验，组内采用配对样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
结 果
1. 外部观察评价兔膝关节功能
N组正常活动，无明显跛行及关节肿胀；M组与O3-2组均出现明显跛行、关节活动度明显受限、关节肿胀及局部疼痛刺激较为强烈；O3-4组与O3-6组患肢局部对疼痛刺激反应弱，轻微肿胀，活动时轻度跛行。
2. 双足平衡支撑力评价兔膝关节功能
治疗前O3-6、O3-4、O3-2、M与N组相比，差异有显著统计学意义(P<0.01)；O3-6组治疗前后相比差异具有显著统计学意义(P<0.01)，O3-4 组治疗前后比较，差异有统计学意义(P<0.05)，O3-2组治疗前后比较，差异无统计学意义 (P>0.05)；治疗后O3-6、O3-4与O3-2组比较，差异有显著统计学意义(P<0.01)，但治疗后O3-6与O3-4组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。医用臭氧治疗KOA至少4周以上，但不能表明治疗时间越长，效果越好（见表1）。
3. 病理观察及 Mankin"s 评分
肉眼观：N组，关节软骨表面光滑，无裂纹、糜烂及溃疡形成，软骨边缘无骨赘形成；M组，关节软骨表面粗糙，可见糜烂及溃疡形成，内侧髁边缘可见骨赘形成；O3-2组，关节软骨表面可见糜烂及溃疡形成，软骨边缘可见骨赘形成；O3-4组与O3-6组大体观察：软骨表面尚光滑，少见糜烂、溃疡，骨赘形成。
光镜下HE染色：N组（见图1A），软骨表面光滑，细胞排列整齐，软骨四层结构清晰，无裂隙；M组（见图1B）软骨表面粗糙不规则，四层结构紊乱，软骨层变薄，软骨细胞显著减少、排列不规则，可见大量纤维软骨细胞及成簇样细胞形成，细胞外基质分解，潮线不完整，大量血管翳形成；O3-2组（见图1C），软骨表面粗糙不规则，软骨四层结构严重紊乱，大量纤维软骨细胞形成，细胞外基质分解，未见明显潮线，可见血管翳形成；O3-4组（见图1D），软骨表面较规则，四层结构尚清晰，软骨细胞数量减少，细胞排列较整齐，可见细胞轻度增生，软骨纤维成分均较模型组及O3-2组少，少量软骨细胞增生，潮线基本完整；O3-6组（见图1E），软骨表面较光滑，四层结构较清楚，软骨细胞数量轻微减少，少量软骨纤维细胞形成，潮线较完整。
（点开图片可观看大图）
光镜下TB染色：N组（见图2A），ECM着色正常，且均匀着色；M组（见图2B），ECM着色中至重度降低，着色不均匀或部分不着色；O3-2组（见图2C），ECM着色明显降低，且着色不均匀，部分不着色；O3-4组（见图2D），ECM着色轻度降低，着色较不均；O3-6组（见图2E）， ECM 着色较正常，着色较均匀。
（点开图片可观看大图）
根据关节软骨病理切片HE及TB染色行Mankin"s评分，M组与O3-2组软骨细胞明显分裂增生，细胞排列紊乱，潮线模糊，甚至可见血管通过，Mankin"s评分差异无统计学意义；O3-4与O3-6组软骨细胞排列稍紊乱，轻度分裂增生，潮线不完整，无明显血管通过及血管翳形成，Mankin"s评分差异无统计学意义，且较接近正常（N组）；O3-6和O3-4组与 O3-2组相比差异具有显著统计学意义（P< 0.01，见表2）。
4. 医用臭氧治疗后关节灌洗液 SOD OD 值
O3-6与N组比较，差异有显著统计学意义(P<0.01)；O3-4与N组相比，差异有统计学意义 (P< 0.05)；O3-2与N组比较，差异有显著统计学意义(P<0.01)，但O3-2较N组明显降低；M与N组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。O3-6与M组比较，差异有显著统计学意义(P<0.01)；O3-4与M组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；O3-2与M组比较，差异有显著统计学意义(P<0.01)，但O3-2较N组明显降低。O3-6和O3-4与O3-2组比较，差异有显著统计学意义(P<0.01)，O3-6与O3-4组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。医用臭氧治疗KOA至少4周以上且治疗时间越长，该结果表明治疗时间越长，SOD生成越多（见表3）。
讨 论
KOA是最常见的慢性退行性疾病，已严重威胁老年人的健康，其致残率高，导致患者日常活动明显受限。传统的治疗方法如康复锻炼、止痛、消炎、理疗、针灸等，都只能暂时缓解疼痛症状，不能控制疾病的进展；Skou和柯雪茹等研究表明，人工全膝关节置换术后大约20%~30%的患者在疼痛、残疾及生活质量方面几乎或根本没有改善，相当一部分患者甚至会患上慢性疼痛。而注射治疗因其全身副作用小较多应用于临床。常见的注射治疗法包括玻璃酸钠和医用臭氧注射治疗，玻璃酸钠注射治疗效果显著，但其价格昂贵，治疗周期较长。近几年来医用臭氧作为一种非药理性的治疗方法已广泛应用于KOA的临床治疗，且疗效确切。
KOA 患者的正常力学轴位发生改变，使关节的最大压力承受部位由外侧胫骨平台转移至内侧胫骨平台，导致内侧关节软骨所承受压力剧增，再加上去除内侧半月板，使关节软骨面之间失去缓冲，直接接触相互摩擦，从而使软骨发生变形损伤。本实验应用经典Hulth改良法，通过改变膝关节的正常力学轴位而制模，该法制模稳定性好。本实验结果显示臭氧关节腔内注射治疗KOA可缓解疼痛、改善膝关节功能。医用臭氧关节腔内注射治疗4周及6周后，关节的双足平衡支撑力、关节软骨病理变化及Mankin"s评分均无显著性差异，提示臭氧治疗4周及6周疗效相当。但与臭氧治疗2周及模型组相比，差异具有统计学意义，且臭氧治疗2周与模型组相比无显著差异，提示臭氧治疗2周疗效差，至少治疗4周以上才有显著疗效。
KOA的发病因素很多，而细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)的合成与分解代谢的失平衡是OA产生的主要原因之一。膝关节是由软骨、软骨下骨、韧带、滑膜、肌肉等许多不同的组织组成的生物力学器官，这些组织的ECM提供了他它们的结构和形式，并定义了他们的生物力学特性。KOA患者关节软骨及滑液中含有大量的细胞因子，当中性粒细胞受到免疫复合物、补体等攻击时，释放出活性氧(ROS)、NO及超氧化物阴离子(O2-)等氧自由基，这些氧自由基含有未配对的电子，形成活泼的羟自由基，打破机体氧化系统与抗氧化系统平衡。羟自由基可激活金属蛋白酶 (Metal Matrix Proteinase, MMP)，同时IL-1、TNF-α等炎性细胞因子也可通过刺激软骨细胞和滑膜成纤维细胞产生MMP，MMP通过降解ECM的重要成分蛋白多糖、骨黏连蛋白、胶原蛋白及软骨基底膜聚糖，加速软骨细胞的衰老与凋亡，导致细胞不能有效地对正常的负荷机制作出反应。但有研究表明，KOA可通过刺激机体产生抗氧化酶，如SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽等，对抗大量氧自由基，以减轻氧自由基对软骨的损伤。医用臭氧不仅可以对抗白细胞产生的细胞因子引发的炎症反应，也可通过诱导合成SOD、过氧化氢酶等抗氧化酶抑制氧化应激反应，从而改善膝关节功能，延缓病情的进展。这一机制符合关节自我修复过程，并能促进修复。
本研究结果表明，医用臭氧关节腔内注射治疗4周及6周后，关节液SOD显著较M组升高，说明医用臭氧可激活机体抗氧化系统，诱导SOD抗氧化酶的生成，对抗KOA产生的过多的氧自由基，减少细胞质胶原蛋白裂解，抑制MMP的形成，进而减少对膝关节软骨的损伤，同时也可以使间质细胞和关节软骨合成增多，刺激软骨进而纤维原细胞增殖，起到一定的修复作用，与先前研究结果一致。且O3-6组较O3-4组升高(P<0.05)，说明臭氧治疗时间越长，疗效越显著。M组关节液SOD含量较正常组升高，但医用臭氧治疗2周后关节液SOD含量较M组显著降低，导致出现该结果的原因可能是正常膝关节液含有少量SOD，KOA的形成可短期内诱导SOD抗氧化酶产生以对抗氧自由基，臭氧治疗2周可能无法有效激活机体抗氧化系统，并且随着病程延长SOD逐渐消耗，同时氧自由基不断增多，激活更多的MMP，因此会出现臭氧治疗2周时关节液SOD反而下降的现象；另外，臭氧本身也属于一种强氧化剂，也可能因为短时间臭氧治疗对软骨的损伤作用大于治疗作用。
从目前研究得出，短疗程医用臭氧治疗KOA未见明显治疗效果，是否具有损伤作用需进一步研究，下一步可通过在正常家兔膝关节注射臭氧，评估臭氧对关节软骨是否有损伤作用。臭氧治疗KOA应不少于4周，并且我们认为随着治疗时间越长效果可能会越好，但从O3-6组与O3-4组的Mankin"s评分及双足平衡支撑力占比的结果比较，两组间差异无统计学意义，分析原因可能因为样本量较小所致，下一步可通过增加样本量或延长治疗时间探讨医用臭氧治疗时间对KOA的影响。
综上所述，医用臭氧关节腔内注射治疗KOA不少于4周时，对修复关节损伤、改善膝关节功能具有显著疗效，在临床上对医用臭氧注射治疗KOA的最佳疗程具有指导意义。
参考文献：薛艳,庞晓林,何军,杨永涛,关圆,张东亚.不同疗程医用臭氧关节内注射对兔膝骨关节炎疗效比较[J].中国疼痛医学杂志,,25(11):871-875.
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