近年来，随着体外诊断行业的不断发展与相关技术的不断成熟，分子诊断POCT产品正在不断增多，其中两大技术流派的产品备受关注：一个流派是采用实时荧光PCR技术进行检测的分子诊断POCT产品，目前很多公司都已开发出了成熟的产品；另一个流派是采用恒温扩增技术进行检测的分子诊断POCT产品，市面上这类产品并不是非常多。那么这两大技术流派的产品有何不同呢？哪一个技术流派的产品是今后的主流呢？本文以杭州遂真生物开发的全自动核酸检测分析系统(AIGS)——实时荧光PCR分子诊断POCT产品流派的新秀，与美艾利尔（Alere）开发的Alere i检测平台（美艾利尔被雅培公司收购后Alere i改名为ID NOW）——恒温扩增分子诊断POCT产品流派的代表，进行一个简单的比较与分析。
两大技术流派的检测原理：实时荧光PCR的AIGS与恒温扩增的Alere i
杭州遂真生物开发的全自动核酸检测分析系统(AIGS)，以实时荧光PCR荧光探针法为基础，进行检测：
这种检测方法根据病原的目的基因，设计合成一个能够与之特异性杂交的引物和荧光探针，根据PCR反应体系中的荧光强度计算出初始样本的核酸模板数量。这是一种传统且经典的检测方法：特异性的荧光探针、引物与提取的核酸模板一起，在Taq酶的作用下，通过热循环进行扩增，反应扩增效率稳定，检测结果普遍具有灵敏度高，特异性好，准确度高，重复性好等优点。
Real-time PCR（实时荧光PCR）
图片源于网络
美艾利尔公司开发的Alere i分子检测平台是一个快速的恒温扩增检测平台，以切口酶恒温扩增技术（Nicking Enzyme Amplification Reaction，NEAR）为基础，进行检测：
这种检测方法根据病原的目的基因，设计带有荧光标记的分子信标引物，由特定捕获的Nicking酶在恒定的温度下驱动扩增反应。由于在恒温条件下进行扩增，故反应体系中的Nicking酶会因为崩解差异而导致扩增效率的差异，在无热循环的线性扩增过程中，扩增效率的差异会不断放大。故此方法的检测时间虽然非常短，但结果的准确性和重复性会因扩增效率的差异而受到影响。
Nicking Enzyme Amplification Reaction（NEAR）
图片源于网络
综上所述，在理论上，所有的恒温扩增体系因为没有热循环，故检测时间短，但扩增效率会存在差异，检测的重复性必然略低于实时荧光PCR。此外NEAR恒温扩增技术的特异性与灵敏度依赖于分子信标引物和Nicking酶，分子信标引物的设计难度大，Nicking酶与其他恒温扩增酶一般都普遍比传统的实时荧光PCR酶要贵，故在检测成本和应用范围等方面，实时荧光PCR技术略优于恒温扩增技术。
两大技术流派产品AIGS与Alere i在检测流程上的区别：
杭州遂真生物开发的全自动核酸检测分析系统(AIGS)包含独特设计的试剂盒与配套的检测仪两个部分，具体的检测流程如下：
将各种样本加入到试剂盒中之后，样本的核酸提取、纯化、扩增、荧光检测等所有反应都在全封闭体系中进行，而独特的卡槽设计不仅实现了样本的大体积上样，还保证了不会有气溶胶释出。整个检测流程中，只有一个加样操作是由人工完成；检测项目的程序及参数设置，均通过扫描二维码的方式自动录入，使用者通过触屏进行仪器的操作，操作简单高效且非常方便，检测结果由系统自动判读，且可以多个检测项目同时独立运行。
美艾利尔（Alere）公司开发的Alere i分子检测平台，也包含了独特设计的试剂盒与配套的检测仪两个部分，具体的检测流程如下：
样本的检测通过三个管完成，先加样至蓝色的Sample Receiver管（其功能是对样品进行纯化），再用白色的Transfer Cartridge管（其功能相当于移液枪）转管后，最后在黄色的Test Base管（其功能是NEAR反应管）中通过仪器进行分析检测。整个检测过程中，有两步人工操作：一是人工加样，二是人工转管。
图片源于网络
两大技术流派产品AIGS与Alere i各自的特点
杭州遂真生物开发的全自动核酸检测分析系统(AIGS)采用磁珠法和临界态多相微流控技术，通过独特的试剂盒系统，实现了对样本的准确且高效的快速检测，具体特点如下：
1、只有一步手工加样操作，2分钟左右即可完成，规避了很多人工操作误差所产生的问题。
2、多通道独立运行，随到随检，无需等待，使用灵活。
3、长宽高均不足40厘米，可置于生物安全柜中，搬运也非常方便，可室外携带。
4、样本纯化、核酸提取、逆转录、扩增一体化完成。从加入样本到最后出结果，需1个小时左右。
5、采用实时荧光PCR探针法检测技术，且逆转录与核酸扩增均由一种TTH酶完成，逆转录温度高，非特异扩增少，确保检测的高特异性、准确性和重复性。
6、检测项目多，各种拭子样本、血样、尿液样本等均可进行检测，目前该产品已经在动物疫病检测和这次新型冠状病毒的检测中广泛使用。
7、仪器操作非常简单方便，检测结果系统自动判读，对检验人员无专业要求，任何检测人员，只需短时间的操作指导即可快速熟练掌握其使用。
8、检测试剂盒独特的卡槽设计，实现大体积上样，可避免样本中病毒浓度低而出现假阴性。
9、加样后即成为全封闭检测体系，安全无污染，中间无转管操作。
美艾利尔（Alere）公司开发的Alere i分子检测平台，采用切口延伸扩增技术（NEAR）来检测病毒核酸，使用特定捕获酶来驱动扩增反应，实现了对样本的准确且高效的快速检测，具体特点如下：
1、整个检测过程只包含2步人工操作：加样操作和转管操作，可以规避一些人员操作误差所产生的问题。
2、单一通道快速运行，恒温快速检测，从加入样本到最后出结果，不超过半个小时。一次只能检测一个样本，一个项目。
3、长宽高均不足30厘米，可置于生物安全柜中，无温控组件，体重轻，搬运方便，适合室外携带，战地等快速检测。。
4、恒温扩增酶成本高且扩增效率不一定均匀，影响检测结果的重复性。
5、检测项目少，可检测的样本类型少，分子信标引物的设计有难度。
6、容易使用，对检验人员无专业要求，简单培训后即可熟练掌握其使用。
7、手工加样后，还要进行一步转管操作，样本纯化，核酸提取、逆转录，扩增在两个试剂管中完成，不是完全的封闭体系，存在污染泄露的风险。
图片源于网络
关于两大流派产品AIGS与Alere i的小结
在这里，我们用一个表格来对恒温扩增技术流派的Alere i与实时荧光PCR技术流派的AIGS进行小结：
对比项目
恒温扩增技术流派的Alerei
实时荧光PCR技术流派的AIGS
检测时间
30min 以下
1个小时左右
检测对象的种类
少
多
检测样本的类型
少
多
灵敏度
高
高
特异性
高
高
重复性
一般
高
准确性
恒温扩增，扩增效率不均匀，准确性一般
热循环扩增，扩增效率均匀，准确性相对较高
应用领域
呼吸道疾病的检测
各种类型的疾病检测
自动化程度
2步人工操作（加样与转管）
1步人工操作（加样）
操作方便性
简单
非常简单
售价
相对更贵
相对便宜
检测的封闭性
封闭性一般，有泄漏风险
封闭性高，无泄漏风险
灵活性
单一通道运行，灵活性低
多通道独立运行，灵活性高
检测通量
通量低
通量高
综上所述，Alerei分子检测平台作为一家大型跨国公司的POCT分子诊断产品，也是恒温扩增技术流派的代表产品。该产品通过采用NEAR技术，可非常快速的实现样本的核酸检测，但该检测平台与其他所有的恒温扩增技术平台一样，对恒温扩增酶和特定的引物与模板依赖很大，故能够检测的项目有限。目前Alere i分子检测平台配套的芯片主要有三种：流感A和B检测芯片，呼吸道合胞病毒(RSV)检测芯片，A族链球菌（Strep A）检测芯片。其中Alere i流感A和B检测芯片是世界上首个 CLIA 豁免的分子检测POCT产品。艾利尔公司被雅培收购后，不仅使得该产品受到了更多的关注，也确定了美Alere i分子检测平台在行业中的重要地位。这类产品所代表的恒温扩增技术流派，也在一些检测场景中被人们使用。
然而，作为分子诊断POCT产品的新秀，杭州遂真生物开发的全自动核酸检测分析系统AIGS，采用传统的实时荧光PCR检测方法，虽然检测时间延长至1个小时左右，但借助于引物和荧光探针的双特异性，以及特有的TTH酶，保证了检测结果的准确性、特异性和重复性。此外通过采用磁珠法和临界态多相微流控技术，结合独特的试剂盒卡槽设计，很好的保证了检测结果的灵敏度。另外，该产品是全封闭体系，只有一步人工加样操作，可以进行多个通道多个项目的独立同时检测，检测项目多、通量高，且对样本种类要求低，所以使用更灵活，操作更安全，结果更准确，应用范围更广和应用场景更多。
目前AIGS已经获得欧盟临床诊断认证（CE IVD），也已经通过了中检院的注册检验，并在动物疫病检测和这次新型冠状病毒的检测中使用，对这次新型冠状病毒的疫情防控和动物溯源，都做出了贡献，也受到了相关权威机构和政府部门的认可（见下图）。我们有理由相信杭州遂真生物开发的全自动核酸检测分析系统AIGS以后会有更加广阔的应用空间。AIGS所代表的实时荧光PCR技术流派也最终会成为分子诊断POCT的主流。
图片源于网络
▼
如果觉得《新前沿 新机遇：两大分子诊断POCT技术流派》对你有帮助，请点赞、收藏，并留下你的观点哦！
