流式细胞术快速测定红细胞渗透脆性的应用 流式细胞术快速测定红细胞渗透脆性的应用
王维维， 袁向亮， 费奇力， 沈立松
（上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092）
摘要：目的 建立流式细胞术快速检测红细胞渗透脆性的方法，评估流式细胞仪测定红细胞渗透脆性的可能性。方法 收集30例抗凝外周血，每例标本均一分为二，1份在采集2 h内检测（正常对照组），另1份经37 ℃孵育24 h（阳性对照组）；另收集3例临床确诊的遗传性球形红细胞增多症患者作为疾病组。分别使用流式细胞术检测各组红细胞渗透脆性。通过流式细胞术测定红细胞残留百分比确定生理盐水和无菌水最佳体积比，确定乙二胺四乙酸（EDTA）和肝素2种抗凝剂对其的影响。另收集14例肝素抗凝标本，同时采用改良Sanford法和流式细胞术测定红细胞残留百分比，对比评价流式细胞术和改良Sanford法测定红细胞渗透脆性的特点。结果 采用流式细胞术检测正常对照组的红细胞残留百分比为72.03% ± 5.68%，明显高于阳性对照组（46.47% ± 15.83%，P＜0.05）；疾病组红细胞残留百分比为5.76% ± 3.54%，明显低于正常对照组（P＜0.001）。当生理盐水和无菌水体积比为1.2∶0.8时，正常对照组和阳性对照组红细胞残留百分比差异最大（P＜0.05）；与EDTA抗凝剂比较，肝素抗凝的外周血更适合于红细胞渗透脆性检测。流式细胞术与改良Sanford法测定红细胞渗透脆性有较好的一致性，但流式细胞术敏感性更高。结论 流式细胞术测定红细胞渗透脆性具有操作简便、敏感性更好等特点，有实际应用的可行性。
关键词：红细胞渗透脆性；流式细胞术；Sanford法
红细胞膜渗透脆性的改变见于多种疾病，如遗传性球形红细胞增多症、地中海贫血等。红细胞渗透脆性试验（erythrocyte osmotic fragility test，EOFT）主要是测定红细胞膜对不同低渗溶液的渗透抵抗力（抗张能力）。目前，临床上常用的EOFT为改良Sanford法，又称简易半定量法。但改良Sanford法操作时间长，容易引起误差且对轻微改变的患者检出率低。而流式细胞术则具有高效、快速、高精度、高准确性等特点。为此，我们建立了流式细胞术测定红细胞渗透脆性的方法，优化测定流程，评价流式细胞术用于红细胞渗透脆性检测的可行性，为临床检测红细胞渗透脆性提供一种快速、有效的新方法。
材料和方法
一、研究对象
随机选取上海交通大学医学院附属新华医院体检健康者及门诊检查人员共30例，其中男20例、女10例，年龄3个月～72岁，排除肿瘤、自身免疫性疾病及血液系统疾病等。每例对象均采集乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和肝素抗凝外周血各2 mL，每份标本均一分为二，其中1份在采集2 h内检测（正常对照组），另1份经37 ℃孵育24 h（阳性对照组）［1］；另外收集3例临床确诊的遗传性红细胞增多症患者作为疾病组。选取7月至12月共4年多时间临床送检的怀疑有红细胞渗透脆性改变的肝素抗凝外周血14例，其中男7例、女7例，年龄1个月～74岁，每例各4 mL，用于流式细胞术和改良Sanford法的对比实验。本研究经新华医院伦理委员会批准。
二、主要试剂和仪器
医用无菌注射用水和医用0.9%氯化钠（NaCl）注射液（生理盐水）均购自上海长征富民医药有限公司；NaCl（分析纯）购自上海申工生物公司。BECKMAN-COULTER FC500流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司），BioTek SYNERGY2酶标仪（美国柏腾公司）。
三、方法
1.改良Sanford法 取13支小试管，编号后按要求加入不同体积的9 g/L NaCl和无菌水，配制成不同浓度的NaCl溶液，见表1。每管加肝素抗凝全血50 μL，轻轻颠倒混匀，放置室温（20 ℃）30 min。将各管混匀1次，3 000×g离心3 min，取上清200 μL至96孔平底板，测定各管上清液吸光度（A）值。以1 g/L NaCl完全溶血管的A值为100%，由各管的A值计算相应的溶血百分率。计算公式：溶血百分率（%）=（测定管A值/完全溶血管A值）×100%，以出现50%溶血的NaCl浓度为红细胞脆性判断浓度。
表1 改良Sanford法采用的NaCl溶液浓度梯度
项目 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 9 g/L NaCl（mL） 4.25 3.75 3.50 3.25 3.00 2.75 2.50 2.25 2.00 1.75 1.50 1.00 0.50无菌水（mL） 0.75 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 4.00 4.50 NaCl（g/L） 8.50 7.50 7.00 6.50 6.00 5.50 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.00 1.00
2.流式细胞术 流式细胞术测定红细胞渗透脆性的设门和分析方法主要参照文献［1］并作适当改进：（1）红细胞悬液的制备。用生理盐水经2步法稀释制得。第1步，取20～30 μL全血［用血量需按照公式进行计算，用血量（μL）= 130/（红细胞数目/μL）/106］。加入1 mL 生理盐水，混匀，尽快执行第2步。第2步，将流式管加入1.2 mL生理盐水，将上述稀释的细胞取10 μL加入其中（直接加入到试管底部，不要沿管壁加入），轻轻地涡悬混匀，此红细胞悬液即可用于流式细胞仪的分析；（2）流式细胞术测红细胞渗透脆性。前向角散射（forward scatter，FSC）和侧向角散射（side scatter，SSC）采用线性放大方式，见图1（a）。FSC和TIME获取散点图也采用线性放大方式，历时204.8 s，划分为8个区域（A～H），每个区域历时约11 s，见图1（b）。将上述悬液混匀上机，待“R1”获取满，按暂停键，移去试管但不终止获取细胞，加入0.8 mL无菌水导致渗透性溶血，继续获取细胞，直到H区结束。I区域不用于计算，每管检测约需2 min。（3）TIME/FSC散点图中每个区域的细胞数作为反映加入无菌水前后细胞残留的参数，细胞渗透溶血的程度以残留红细胞百分比表示，使用公式计算。红细胞残留百分比（%）=［（G区细胞数+H区细胞数）/2］/［A区细胞数×1.2/2.0］×100%。G和H用来计算红细胞残留百分比。式中1.2/2.0为校正系数，需要校准A区细胞数是因为加入的0.8 mL无菌水导致细胞数被稀释；（4）结果判读。如红细胞残留百分比降低，红细胞脆性则增加。
四、流式细胞术测定红细胞渗透脆性的条件优化
1.生理盐水和无菌水体积比的优化 采用流式细胞术测定红细胞渗透脆性时需使用生理盐水和无菌水，二者加入比例不同，渗透力不同，红细胞残留百分比也不同，因此需优化二者的使用比例，选取最佳的体积比。生理盐水∶无菌水的体积比取5种比例：1.0∶1.0、1.1∶0.9、1.2∶0.8、1.3∶0.07、1.4∶0.6。采用流式细胞术分别检测生理盐水和无菌水不同体积比时正常对照组和阳性对照组的红细胞残留百分比。
2.抗凝剂对流式细胞术检测红细胞渗透脆性的影响 改良Sanford法测定红细胞渗透脆性时不能用枸橼酸盐、草酸盐和EDTA盐抗凝，以免增加离子浓度，改变溶液渗透压；使用流式细胞术测定红细胞渗透脆性时，有研究使用EDTA抗凝的外周血，而 《临床检验基础》建议使用肝素［2］。因此，本研究比较了EDTA和肝素抗凝外周血的红细胞渗透脆性。
五、流式细胞术和改良Sanford法检测红细胞渗透脆性的方法学对比
分别采用流式细胞术和改良Sanford法检测14例临床怀疑有红细胞渗透脆性改变的肝素抗凝外周血标本。（1）改良Sanford法：正常红细胞溶血的NaCl浓度范围为4.00～4.45 g/L，当待测红细胞溶血的NaCl浓度高于此范围上限时，判定为红细胞渗透脆性增高，标记为“+”；（2）流式细胞术：按阳性对照组的红细胞残留百分比范围进行判定，当待测红细胞残留百分比低于其上限时判定红细胞渗透脆性增高，标记为“+”。
六、统计学方法
采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。数据以
±s表示，组间比较采用配对 t检验，率的比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、流式细胞术测定红细胞渗透脆性的设门方法
由于红细胞直径较小，因此采用线性放大模式设门，见图1（a）；红细胞渗透脆性测定采用线性FSC为纵轴，时间为横轴，采用时间连续性设门，见图1（b）。
图1 流式细胞术测定红细胞渗透脆性的设门方法
注：（a）采用线性放大模式设门收集红细胞；（b）时间连续性设门（以FSC-lin为纵轴、时间为横轴）
二、采用流式细胞术检测红细胞渗透脆性
流式细胞术检测结果显示，采集2 h内测定的肝素抗凝新鲜外周血标本的红细胞残留百分比为72.47%，而同一份标本经37 ℃孵育24 h后测得的红细胞残留百分比为42.85%。见图2。
流式细胞术结果显示正常对照组红细胞残留百分比为72.03%±5.68%，明显高于阳性对照组（46.47%±15.83%，P＜0.05）；疾病组的红细胞残留百分比为5.76% ± 3.54%，明显低于正常对照组（P＜0.001）。见图3。
三、流式细胞术测定红细胞渗透脆性的条件优化
1. 生理盐水和无菌水体积比的优化 当生理盐水和无菌水体积比≥1.3∶0.7时，红细胞残留百分比偏高，正常对照组和阳性对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；当二者体积比≤1.0∶1.0时，红细胞残留百分比低，正常对照组和阳性对照组之间差异亦无统计学意义（P＞0.05）；当二者体积比为1.2∶0.8时，不管是使用EDTA抗凝还是使用肝素抗凝，阳性对照组红细胞残留百分比（EDTA：5.02%±3.66%，肝素：41.98%±23.31%）均明显低于正常对照组（EDTA：61.48%±13.79%，肝素：68.87%±9.79%；P＜0.05）。见图4。因此，本研究采用的生理盐水和无菌水体积比为1.2∶0.8。
2.抗凝剂的选择 正常对照组中EDTA抗凝标本的红细胞残留百分比（64.68%±11.36%）明显低于肝素抗凝标本（70.32%±9.13%，P＜0.05），即EDTA抗凝血红细胞渗透脆性高于肝素抗凝组（P＜0.05）。阳性对照组中EDTA抗凝标本的红细胞残留百分比下降更加明显，为5.76%±3.17%，明显低于肝素抗凝标本（49.65%±13.80%，P＜0.01）。见图5。从图5（b）也可以看出EDTA抗凝标本经37 ℃孵育后，红细胞残留百分比极低，不适合做孵育实验，故本研究选用肝素作为抗凝剂。
图2 流式细胞术检测肝素抗凝新鲜外周血标本和经37 ℃孵育24 h的标本的结果
注：（a）肝素抗凝新鲜外周血标本（采集2 h内测定），红细胞残留百分比为72.47%；（b）37 ℃孵育24 h的标本，红细胞残留百分比为42.85%
图3 正常对照组、阳性对照组和疾病组红细胞残留百分比的比较
注：（a）阳性对照组与正常对照组红细胞残留百分比的比较；（b）疾病组与正常对照组红细胞残留百分比的比较
图4 流式细胞术测定红细胞渗透脆性的条件优化
注：（a）不同生理盐水和无菌水体积比的红细胞残留百分比；（b）不同抗凝剂及不同生理盐水和无菌水体积比的红细胞残留百分比，1.1∶0.9、1.2∶0.8为生理盐水和无菌水的体积比；
正常对照组、
阳性对照组，*P＜0.005、**P＜0.001
图5 抗凝剂对红细胞残留百分比的影响
注：（a）EDTA和肝素抗凝的新鲜标本；（b）37 ℃孵育24 h后的EDTA和肝素抗凝标本
四、流式细胞术和改良Sanford法检测红细胞渗透脆性的方法学对比
流式细胞术测定阳性对照组的红细胞残留百分比范围为30.64%～62.30%，因此当待测红细胞残留百分比低于其上限时，判定为红细胞残留百分比降低，即红细胞渗透脆性增高。改良Sanford法检出红细胞渗透脆性增高的7例标本，流式细胞术也可以检出。流式细胞术测定无异常的3例标本改良Sanford法检测也无异常。但有4例标本流式细胞术检测结果为红细胞渗透脆性增高，而改良Sanford法未检测出异常，依据临床诊断作为金标准进行鉴定。查阅临床资料，此4例标本中1例诊断为“遗传性球形红细胞增多症+Gilbert综合征可能”、1例诊断为“骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）合并缺血性心脏病”、2例诊断为“低色素性贫血”，由此可见，流式细胞术的敏感性略高于传统的改良Sanford法。四格表χ2检验结果显示2种方法之间差异无统计学意义（χ2=2.25，P＞0.05）。见表2。
表2 Sanford 法与流式细胞术测定红细胞渗透脆性结果的比较
改良Sanford法 流式细胞术+ -+ 7 0 - 4 3
讨 论
红细胞膜渗透脆性的改变见于多种疾病。目前临床上常用的EOFT为改良Sanford法，又称简易半定量法。但是改良Sanford法中涉及到差别细微的不同浓度的NaCl溶液，要求配制的各种NaCl溶液必须准确，各管中加入的血量应相等，操作过程中需减少机械震动，避免人为溶血，而且存在结果判定时受主观影响及操作时间长等不足，对轻微改变的患者检出率也较低，因此在红细胞渗透脆性测定中急需一种新的、简便、准确、特异性高、敏感性好的方法。
流式细胞术在红细胞测定中应用越来越广泛［3-6］。在遗传性球形红细胞增多症（hereditary spherocytosis，HS）中，使用流式细胞术能检测出红细胞膜及功能的异常［7］，并具有较高的敏感性和特异性，因此流式细胞术在HS的诊断中是一个较好的检测方法［8］，并被推荐用于HS和遗传性热异形性红细胞增多症的鉴别［9］。有研究者将流式细胞术用于红细胞膜异常检测，包括HS、遗传性椭圆形红细胞增多症、口形红细胞增多症、焦磷酸异性红细胞病、东南亚卵形红细胞症等［10］。
利用流式细胞术测定红细胞渗透脆性在国外已有报道［1，11］，国内尚未见相关报道。由于红细胞直径较小，必须采用线性设门策略［1］。本研究依据设门分析方法建立流式细胞术测定红细胞渗透脆性的方法，并证实其有效性。由于流式细胞术测定红细胞渗透脆性时涉及的试剂主要是生理盐水和无菌水，而二者的体积比直接影响红细胞残留百分比，所以确定生理盐水和无菌水比例尤为重要。本研究先沿用了已报道的生理盐水和无菌水体积比（1.1∶0.9）［1］进行测定，但使用流式细胞术测定正常人群的红细胞残留百分比偏低，为此本研究对比了不同体积比时红细胞残留百分比，确定采用生理盐水和无菌水体积比为1.2∶0.8时，具有较好的检测效果。建议各实验室应探索合适的生理盐水和无菌水体积比。实验室自制双蒸水并不适合，原因可能是自来水pH值偏小，对红细胞渗透脆性影响较大，因此本研究建议使用医用无菌水。
关于抗凝剂的使用，不同的研究有不同的选择。有研究应用流式细胞术测定红细胞渗透脆性时使用EDTA抗凝剂［1］。本研究结果显示，在使用流式细胞术测定红细胞渗透脆性时，肝素抗凝的结果优于EDTA抗凝，所以建议在红细胞渗透脆性检测时选择肝素抗凝。
为了进一步评估流式细胞术测定红细胞渗透脆性方法的可行性，本研究同时采用流式细胞术和改良Sanford法检测14例临床标本的红细胞渗透脆性。但由于引起红细胞脆性改变的疾病，如HS好发于北欧［12-13］、椭圆型红细胞增多症好发于西非等疟疾高发区［12-13］、自身免疫性溶血性贫血伴球形红细胞增多症病例在我国少见［14］，上海地区阳性病例更是难以收集，因此本研究在4年多的时间内仅收集到14例临床怀疑有红细胞渗透脆性改变的标本。本研究结果显示2种方法具有较好的一致性，但流式细胞术可以鉴别出一些轻微改变的红细胞脆性变化，敏感性高于传统的改良Sanford法。有研究比对了5种方法测定HS患者红细胞渗透脆性的变化，认为流式细胞术具有较高的敏感性及特异性［15-16］，这与本研究的结论相符。而且，流式细胞术测定仅需20～30 μL全血，耗时不足3 min，而改良Sanford法需要3～4 mL血量，耗费时间接近1 h，显示出流式细胞术测定红细胞渗透脆性的优势：用血量少、需要试剂少、时间效率高，而且可以定量［1］。由于本研究例数较少，确诊的相关疾病例数也较少，故流式细胞术在红细胞渗透脆性检测中的应用还有待进一步完善和评估。
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（本文编辑：范基农）
Application of flow cytometry for the rapid determination of erythrocyte osmotic fragility
WANG Weiwei， YUAN Xiangliang， FEI Qili， SHEN Lisong.
（Department of Clinical Laboratory， Xinhua Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）
Abstract：Objective To establish a rapid determination of erythrocyte osmotic fragility by flow cytometry，and to evaluate the feasibility of determining erythrocyte osmotic fragility by flow cytometry. Methods A total of 30 anticoagulation peripheral blood specimens were collected，and each specimen was divided into 2 parts，one group collected within 2 h as normal control group and another group incubated at 37 ℃ for 24 h as positive control group. A total of 3 patients diagnosed as hereditary spherocytosis were enrolled as disease group. The erythrocyte osmotic fragility was determined by flow cytometry. The residue percentage of red blood cells was analyzed by flow cytometry. The optimal volume ratio of normal saline and sterile water was identified. The influence of ethylene diamine tetraacetic acid（EDTA）and heparin anticoagulants was evaluated. A total of 14 cases of heparin anticoagulation specimens were collected，and the red blood cell residue percentage was determined by improved Sanford and flow cytometry simultaneously. The characterization of determining erythrocyte osmotic fragility by flow cytometry and improved Sanford was evaluated. Results By flow cytometry，red blood cell residue percentages were 72.03% ± 5.68% in normal control group and 46.47% ± 15.83% in positive control group（P＜0.05）. The disease group showed a significant reduction in red blood cell residue percentage（5.76% ± 3.54%） compared to that in normal control group（P＜0.001）. When the volume ratio of normal saline to sterile water was 1.2∶0.8，there was significant difference of red blood cell residue percentage between the 2 groups（P＜0.05）. Compared with EDTA anticoagulant，heparin anticoagulant was more suitable for the determination of erythrocyte osmotic fragility. There was a good consistency between flow cytometry and improved Sanford in the determination of erythrocyte osmotic fragility，but flow cytometry had better sensitivity than improved Sanford. Conclusions Flow cytometry has the characteristics of operation simplicity and sensitivity，and has a practical application feasibility in the determination of erythrocyte osmotic fragility.
Key words：Erythrocyte osmotic fragility； Flow cytometry； Sanford
文章编号：1673-8640（）010-0911-06
中图分类号：R446.1
文献标志码：A
DOI：10.3969/j.issn.1673-8640..010.017
作者简介：王维维，女，1982年生，博士，主管技师，主要从事流式细胞术临床检验工作。
收稿日期：（-08-18）
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