撰稿 | 鲁林荣教授课题组
01 背景介绍
一直以来，我们认为只有T细胞和B细胞介导的适应性免疫反应才有免疫记忆。T细胞和B细胞表面具有高度多样性的TCR和BCR分子，对不同的抗原通过克隆的选择性激活和扩增实现特异性免疫反应，且在此过程中产生抗原特异性记忆细胞，在再次“相遇”时快速激活，发起比初次“相遇”时更快速激烈的免疫反应。
近年有少量研究提示，NK细胞和髓系细胞也可能具有免疫记忆的特征。但是它们形成的“记忆”能否像T细胞或B细胞那样具有特异性，并激发更强烈的特异性免疫反应，目前仍未可知；这些固有免疫细胞实现“记忆”的识别方式和调控分子更是鲜有报道。
02 文章创新点
本研究是一个具有很大的创新性和开创性意义的研究，作者用适应性免疫的研究思路和严谨的移植排斥的小鼠模型，验证了固有免疫细胞对MHC I分子的免疫记忆特性，并对分子机制做了一定的阐述。
这一发现最值得赞叹的是揭示了固有免疫细胞的免疫记忆现象，其研究中关注的机制在一定程度上解释了这一现象，但其中的复杂性、同种异体识别的分子异质性，和免疫记忆响应的具体过程，还非常值得进一步的探索。此外，作者们关注的PIR分子在移植排异过程中起到的免疫记忆调节作用，或对今后的移植排斥治疗策略有重要的提示意义。
03 图片解析
为了直接观察髓系细胞在移植实验模型中的二次免疫反应，并且排除T、B等细胞的干扰，作者选用了体内没有T细胞、B细胞、NK细胞和ILC细胞的B6 Rag-/- Il2rg-/-小鼠作为移植实验中的受者。
首先，作者对来自各背景的CD45.1转基因小鼠的脾细胞进行辐照后，将细胞回输至受者小鼠体内，并在免疫后的指定时间，用BALB/c背景的小鼠骨髓进行移植，并观察一定时间后移植物内的浸润的单核细胞数量。结果发现，在移植前经过BALB/c细胞免疫的小鼠移植物内的单核细胞数量显着高于未免疫或经过其他背景细胞免疫的小鼠（图A），相似的现象也可以在经C3H背景的脾细胞免疫后再移植同背景骨髓的小鼠中观察到（图B）。为了进一步排除免疫过程和移植物中的T、B、NK等细胞在这一过程中的作用，作者检测了移植物中CD45.1+细胞，发现受者小鼠的移植物和脾脏中并没有CD45.1+细胞残留；又采用不同背景的Rag-/- Il2rg-/-小鼠细胞来进行免疫和移植，发现上述观察到的现象依然存在（图C，D）。通过以上实验结果，提示单核细胞存在对相同来源移植物的免疫记忆，且不依赖于其它淋巴细胞。
为了进一步明确具体有记忆的单核细胞亚群，作者随后对经过自体细胞或异体细胞免疫的B6 Rag-/- Il2rg-/-小鼠移植物内炎性Ly6Chi单核细胞进行分选，并回输至未免疫的B6 Rag-/- Il2rg-/-小鼠中进行骨髓移植实验，发现回输了经异体免疫的Ly6Chi单核细胞的小鼠可以体现出与前述的二次免疫相似的单核细胞扩增的情况（图E）。这提示了Ly6Chi单核细胞可以介导对同种异体抗原的免疫记忆，且这种记忆可以维持若干周以上。
此外，已知巨噬细胞对同种异体细胞的杀伤需要由初次接触时CD40受体信号介导。为了检测巨噬细胞是否也有这样的免疫记忆功能，作者在对B6 Rag-/- Il2rg-/-小鼠给以BALB/c小鼠脾细胞免疫时同时给以CD40激动型抗体，在免疫一段时间后，再以1：1的比例回输不同背景的2种细胞，发现经BALB/c细胞免疫的小鼠可以在一定时间后特异性的杀伤BALB/c小鼠细胞，而对其他细胞无杀伤作用（图F）。这表明巨噬细胞也对同源异体抗原具有免疫记忆的能力。
我们都知道，MHC蛋白在人或小鼠中都是介导同种异体识别的关键分子。随后，作者就想要探究单核细胞和巨噬细胞这种同种异体识别的免疫记忆是否是通过识别MHC分子实现的。因此作者选用了BALB.B小鼠来进行试验验证，这种小鼠具有与BALB/c小鼠相同的遗传背景，但有着与B6小鼠相同的MHC H-2的基因。用BALB.B免疫并再度移植B6 Rag-/- Il2rg-/-小鼠时，并没有发生任何的单核细胞增多的情况（图G）。
（各背景小鼠的MHC单倍型）
此外，作者也检测了巨噬细胞对同种异体的识别是否依赖于MHC。发现小鼠在经过BALB/c细胞免疫后，虽然可以杀伤再次遇到的BALB/c细胞，但无法对b2m敲除的BALB/c细胞进行免疫记忆性杀伤，也无法对BALB.B细胞进行杀伤（图H）。此外，作者还检测了经过BALB/c免疫的B6 Rag-/- Il2rg-/-巨噬细胞对不同H-2四聚体的识别能力，发现可以特异性的识别H-2Dd和H-2Kd（图I）。以上的结果说明了单核细胞和巨噬细胞的免疫记忆能力是依赖于异体MHC分子识别实现的。
通过数据库检索和文献阅读，PIR（paired Ig-like receptors）是可表达于单核巨噬细胞、会随着细胞活化而表达提高，并可以与MHC分子结合的一种膜蛋白。PIR家族具有6种激动型的PIR-A和1种可传递胞内抑制信号的PIR-B。作者预测，PIR很有可能是使单核巨噬细胞发生对MHC分子特异性识别的关键分子。
于是作者检测了Ly6Chi和Ly6Clo的单核细胞表面的PIR-A/B分子的表达，发现其表达在Ly6Chi的单核细胞上较高（图A）；相似的，PIR-A分子在免疫后的巨噬细胞上也有较高的表达（图B）。且在使用anti-PIR-A/B抗体后，可以有效的阻止单核细胞在二次免疫时的扩增（图C-D）和巨噬细胞二次免疫时的杀伤作用（图E）。
随后，作者在细胞系中分别过表达了PIR-A的6中亚型，发现其中PIR-A3具有与H-2Dd四聚体最强的结合能力（图F-G）。
因此作者构建了PIRA3/FC融合蛋白，并检测了PIRA3/FC可以在适合的浓度时可以与BALB/c细胞特异性结合（图H）。随后作者在二次免疫的模型中用了PIR-A3/FC融合蛋白，发现可以有效阻止对BALB/c免疫记忆的治疗效果（图I-J）。但有趣的是，PIR-A3/FC对C3H小鼠的二次免疫反应却没有治疗的效果，这提示单核巨噬细胞对不同MHC单倍型的识别可能是由PIR分子的不同亚型或多种分子介导的。随后作者又构建了pira和pirb敲除的B6 Rag-/- Il2rg-/-小鼠。发现在初次免疫反应时，B6 Rag-/- Il2rg-/- Pira-/-小鼠的单核细胞数量与B6 Rag-/- Il2rg-/-小鼠并没有区别，但其二次免疫反应的强度却明显的降低了（图K）。由此说明，PIR-A是介导固有免疫记忆的关键分子。
作者检测了B6 Rag-/- Il2rg-/- Pirb-/-小鼠和B6 Rag-/- Il2rg-/- Pira-/-小鼠在经过不同背景的细胞免疫后，对MHC H-2亚型的识别能力，发现Pira敲除后，单核细胞失去了对各种H-2亚型的识别能力（图A）。
随后，作者对经过不同背景的细胞免疫1周或4周后的B6 Rag-/- Il2rg-/-小鼠的脾单核细胞进行了单细胞测序。从拟时序分析的情况，可以将细胞分为S期（起始阶段）和3个E期（增殖阶段）（图B），统计发现自体免疫的单核细胞更多的停留在了S期；而异体免疫的单核细胞的S期比例明显下降，E1-3的比例提升（图C）。此外，Pira的表达在E期中明显提高（图D），且不同的单核细胞更倾向于表达一种Pira亚型（图E）。这些信息提示，单核细胞可能是通过对特定的非己MHC分子发生了克隆扩增而行使了免疫记忆的功能。
最后，作者试图在移植排斥的模型中检验靶向PIR分子的治疗效果。
作者采用了肾移植的试验模型，发现Pirb敲除小鼠会发生严重的急性移植物排斥，导致小鼠在移植早期大量死亡，而Pira-/-和WT小鼠可以很好的存活，血清肌酐水平也显示出了相似的情况；而对Pirb-/-小鼠给以PIR-A3/FC抗体治疗后，小鼠的存活率和血清肌酐水平都得到了明显的改善（图A-B）。此外，通过肾脏切片和评分显示，WT小鼠会发生严重的慢性排斥反应，而Pira-/-小鼠的排斥反应明显的缓解了，而且对排斥反应严重的Pirb-/-小鼠给以PIR-A3/FC抗体治疗也可以明显的缓解慢性排斥反应（图C-D）。
另外，作者还用了心脏移植的模型，对比评估了PIRA3/FC与已在临床上得到应用CTLA4Ig的治疗效果。CTLA4Ig是通过阻断T细胞上CD28分子和CTLA4分子对靶细胞的B7分子的识别而发挥作用的，可以有效的抑制移植排异中T细胞的活化。实验发现，PIRA3/FC可以一定程度的降低移植后急性排斥导致的死亡率，但治疗效果稍弱于CTLA4Ig。不过令人欣喜的是，CTLA4Ig和PIRA3/FC的联合使用具有远远优于单独用药的治疗效果，不仅完全控制了急性排斥造成的小鼠死亡，且大大缓解了心脏移植后的血管炎的排斥反应（图E-F）。
这一部分结果提示，PIR-A是单核巨噬细胞免疫记忆不可或缺的调控蛋白，是促进同种异体排斥的一个重要信号，而PIR-B在这一过程中起到了抑制的作用。
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