组织亲水代谢物提取
准备:
提取液:80%(v/v)甲醇,放入-80℃,预冷,2h或者过夜。
1.5毫升EP管提前标记好;
提取:
1) 称取适量的组织,20-50mg,加入500μL预冷好的80%甲醇,干冰上匀浆,保持每个样品的重量,匀浆功率和时间一致。
2) 涡旋30s,置于-80冰箱2h。
3) 离心,4℃,12000rpm,20min。
4) 小心吸取上清到新EP管,真空悬干;沉淀用1M KOH复溶,测定蛋白浓度。
5) 置于干冰上送样。
注意:称重过程尽快,避免小分子降解或者相互转化。拿取EP管的时候,手和管子的接触位置在没有样品的空余位置,避免手温“加热”样品。
细胞代谢流实验
准备
1) 铺细胞,根据对细胞生长速度的了解控制细胞密度,使得在收样的时候,每组细胞数目一致。同时,根据目标代谢物的含量,决定细胞数量(6cm,10cm还是15cm皿)。
2) 待细胞生长正常,(一般12-24小时)更换原来的培养基为同位素标记的培养液,同位素标记的培养液配制参看下表举例。
切记:代谢流实验需要一盘正常培养的细胞做对照。即送样的时候包括:标记的样品和未标记的1份正常样品。
Normal
Glucose tracing
Glutamine tracing
DMEM
DMEM depleted glucose
DMEM depleted glutamine
FBS
Dialyzed FBS
Dialyzed FBS
Labelled glucose
Labelled glutamine
提取:
1) 加入适量的预冷好的80%甲醇,6cm皿加入500μL,10cm加入1mL,置于-80冰箱2小时。
2) 刮刀刮下细胞,到新的EP管,再用200μL预冷好的80%甲醇润洗培养皿。刮刀每刮完一份样品,用超纯水洗净,擦干,再刮下一个样品。
3) 离心,4℃,12000rpm,20min;沉淀用1M KOH复溶,测定蛋白浓度。
4) 小心吸取上清到新EP管,真空悬干。
置于干冰上送样。
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