Key Laboratory of Biodiversity Formation Mechanism and Comprehensive Utilization ofQinghai-Tibetan Plateau in Qinghai Province
概 述
OVERVIEW
Journal of Pharmaceutical Analysis(IF=2.673) 刊载了武汉大学药学院陈子林团队(E-mail:chenzl@) 发表的论文"Identification and quantification of the bioactive components in Osmanthus fragrans roots by HPLC-MS/MS"(Publication time：5,June, ; DOI:https :// / 10.1016/ j.jpha..06.010)。该论文阐述了用HPLC-MS / MS鉴定桂花根中具有生物活性的成分。
前 言INTRODUCTION
桂花（O. fragrans）以其令人愉悦的气味而闻名，它被广泛种植在中国的美化环境中。桂花通常用于生产芳香精油，保健品和食品添加剂，这可以给当地带来经济利益。迄今为止，大多数与桂花相关的研究都集中在花朵的生物活性探索和实际应用上。近年来，也有一些关于桂花果实的研究。
实际上，桂花的资源利用不仅限于花和果实，其根还可以用作功能性饮料和茶的成分。在中药的使用中，桂花根通常用于缓解胃痛，牙痛，风湿性麻木，肌肉和骨骼痛。为了解桂花根作为中药应用的物质基础，对桂花的化学成分进行了研究。已经发现有许多黄酮类，木脂素类，环烯醚萜类和苯乙醇类化合物，但是关于桂花的化学成分的信息仍然有限。柱色谱法是分离和纯化的常用技术，但很难分离仅少量或痕量或共洗脱的那些。HPLC-MS / MS结合了LC的高分离效率，MS的高灵敏度和分子结构阐明能力等特性。异构体的不同裂解模式有利于说明精细的区别，它可以为准确分离和纯化单体组分提供指导，从而避免了很多重复劳动。本文通过HPLC-MS / MS鉴定了桂花根中的苯乙醇苷类和木脂素类。建立了高灵敏度的HPLC-MS/ MS方法，用于测定桂花根不同品种中的毛蕊花糖苷，异麦角甾苷，橄榄苦苷和连翘苷的含量。
目前，桂花根的有效成分尚未得到全面研究。事实证明，只有从桂花根中分离出的未知木脂素才具有抗炎和止痛作用，这不能清楚地阐明桂花根传统药物作用的基础。网络药理学是基于系统生物学和多方向药理学的理论。生命与疾病系统的网络分析已成为揭示中医药实质性基础并阐明其传统治疗作用机理的一种新的综合方法。因此，通过网络药理学分析了桂花根发挥其传统药效的治疗材料基础和机理。有利于桂花根资源的综合开发。
方 法METHOD
1. 正丁醇提取物中化学成分的表征
表1.HPLC-ESI-MS/MS对桂花根化学成分的研究。
用HPLC-MS / MS分析了桂花根的化学物质基础。负离子模式和增强子离子模式都被用来识别相应的信号。如表1和图1所示，表S1初步确定了从桂花根提取物中鉴定出36种化合物。除R4，R23，R34和R35外，共有32种成分首先在桂花根中发现。通过EPI扫描进行灵敏分析，发现并区分出许多新的异构体。此外，这项工作中首次报道了化合物R36的结构。通过高分辨率质谱数据验证了该表征，以进一步确认这些成分的确切分子量。木质素和酚类化合物（包括类硒化物和苯乙醇类葡萄糖苷）被证明是主要成分。大部分苯乙醇类糖苷是羟苯乙醇和甲基油苷衍生物的糖苷配基，它们以不同的组合与葡萄糖，鼠李糖或芹菜糖相连。
图1.对桂花根提取物主要成分的化学结构进行了鉴定。
2. 优化提取因子和HPLC-MS / MS条件
为了提取毛蕊花糖苷，异麦角甾苷，橄榄苦苷和连翘苷，考虑到苯乙醇糖苷和木脂素的提取效率，对提取过程中的各种因素进行了优化，包括60％至100％甲醇的提取溶剂，提取量 溶剂范围为8至20 mL，萃取时间为15至60 min。定量的最终优化方法描述如下：取0.1 µg桂花根，与12 µmL 60％甲醇混合，超声提取45 µmin。
采用MRM扫描模式进行定量分析。为了获得高灵敏度，指定了碰撞能量，脱聚点位和碰撞单元出口点位这三个因素，以找到具有高响应性的母/子离子对（如图S1所示）。
图S1.桂花根正丁醇萃取物负离子和正离子模式的总离子色谱图。3.方法验证
线性方程是通过绘制相应的峰面积相对于不同的浓度得出的。所有线性方程均表现出极好的线性，相关系数（r）高于0.9996。定量限度（LOQs）为：毛蕊花糖苷为4.51 ng / mL，异麦角甾苷为4.09 ng / mL，橄榄苦苷为4.58 ng / mL，而连翘苷的定量限为4.45 ng / mL。因此，同时测定四种分析物的HPLC-MS / MS方法具有更高的灵敏度。为了测试该方法的日内和日间精度，新鲜制备了标准混合物，分别在同一天和连续3天注射五次。六个样品的重复性测试的RSD范围为1.59％至3.64％，存储在15°C并在0、4、8、12、16°h，19°h和23°h之后进行分析的样品的稳定性测试的RSD分别为如表2所示，范围从1.79％到3.24％。评估了所提出方法的准确性，方法是将0.05μg的桂花根粉末与已知量的四种参考物质混合，然后通过样品提取制备方法。结果列于表2，表明HPLC-MS / MS方法具有良好的准确性，回收率在95.68％至104.56％之间，而所有RSD均小于5％。
表2.使用四种目标分析物进行方法验证。
4.在桂花根中的应用
图3.四种生物活性化合物的典型MRM色谱图:(A)标准溶液;和(B)中提取。峰鉴别:R15：毛蕊花糖苷，R21：异麦角甾苷， R31：橄榄苦苷， R34：连翘苷。
采用HPLC-MS / MS联用的方法对桂花根中的四种生物活性成分进行了测定。连翘苷，橄榄苦苷，毛蕊花糖苷和异麦角甾苷分别属于木脂素类，环烯醚萜类和苯乙醇类，并被证明具有多种生理活性。它们被认为是桂花根中的生物活性成分，并用于评估不同品种的质量。四种生物活性化合物的典型MRM色谱图如图3所示，其含量结果列于表3。十二个批次中橄榄苦苷和连翘苷的含量相对稳定。毛蕊花糖苷和异麦角甾苷的含量变化多达10倍。
表3.12批桂花根中4种化合物含量(mg/g)的比较。
5.网络药理分析
图4.效应物质(红色)、疾病(宝蓝色)、重要靶点(橙色)和其他靶点(蓝色)相互作用网络。
在图4中，表明所涉及的疾病主要是炎症，心血管疾病和癌症。可以看出，类风湿关节炎是其中的一种相关疾病，这与桂花根的传统药效学是一致的，例如“治疗肌肉疼痛”和“治疗风湿病”。它的相关目标是PRKCQ，MMP9，MMP3，MMP2和MMP1。与基因PRKCQ相关的基因本体论注释包括转移酶活性，转移含磷基团和蛋白质酪氨酸激酶活性。基质金属蛋白酶（基质金属蛋白酶，MMP）是锌依赖性内肽酶，是ECM降解中的主要蛋白酶。MMP能够降解几种细胞外分子和多种生物活性分子。另一方面表明它主要通过影响与胶原蛋白分解和细胞外基质分解有关的生物学过程而起作用。与这些靶标有关的化合物是10-羟基四氢侧核苷，女贞苷，橄榄苦苷，osmanthuside H和断氧化马钱子苷。以上结果为我们研究桂花根发挥传统药效学的机理提供了证据。
结 果RESULT
开发了有效和灵敏的HPLC-MS方法，用于表征和定量桂花根中生物活性成分。在桂花根中首次发现了32种成分，其中一种化合物是首次报道。验证了同时测定毛蕊花糖苷，异麦角甾苷，橄榄苦苷和连翘苷的方法的灵敏度和准确性。然后用于测定不同品种的桂花根中生物活性成分的含量。此外，网络药理分析表明，桂花根可有效治疗炎症，心血管疾病，癌症和类风湿性关节炎，这与桂花根的传统药效学是一致的，将有利于桂花根的全面发展。
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