Key Laboratory of Biodiversity Formation Mechanism and Comprehensive Utilization ofQinghai-Tibetan Plateau in Qinghai Province
概 述
OVERVIEW
Cell Stress and Chaperones (IF=2.892)上刊载了来马来西亚丁加努大学（UMT）海洋生物技术研究所Yeong Yik Sung研究团队(E-mail: yeong@umt.edu.my)发布的“Cyst viability and stress tolerance upon heat shock protein 70 knockdownin the brine shrimp Artemia franciscana”(Publicationtime : 22 April ; DOI: https: /// 10.1007/s 12192-020-01113-0)。这项研究首次揭示了Hsp70基因敲除对卤虫囊泡的发育、形态和胁迫耐受性的影响。
前 言TNTRODUCTION
卤虫被称为“极端微生物”，因为它们能够承受广泛的环境压力。在有利的条件下，卤虫雌性的卵囊会孵化出现活的无节幼体，然后在成年前经历一系列蜕皮。在不利或极端的情况下，雌性释放卵生发育中的包被胚胎，进入滞育期。如果条件有利，卵囊就会孵化成无节幼体，或者进入休眠状态，直到适合发育的条件出现。
滞育是一种发育迟缓的生理状态，其特点是休眠，代谢活动大大降低，并增强了从甲壳类动物到哺乳动物等生物的应激耐受能力。滞育可以确保其在不利的环境条件下生存。热休克蛋白（Hsp）在许多生物体的滞育过程中起着重要作用，包括卤虫。热休克蛋白已被证明可以防止蛋白质损伤，并在滞育期间抵御广泛的环境干扰。在压力的情况下，不止一个热休克蛋白被诱导，很可能是因为分子伴侣如热休克蛋白在网络中一起发挥作用。Hsp90、Hsp70、Hsp60，小热休克蛋白（sHsps）在滞育期间合成，它们可能在滞育终止后的蛋白质复性中起协同作用。sHsps通过疏水相互作用与变性蛋白结合，通常通过共因子传递给Hsp70，Hsp70在TP依赖性蛋白复性中起重要作用。热休克蛋白90与热休克蛋白70相互作用，提高蛋白质折叠效率，两种伴侣蛋白都可以在没有TP的情况下分离蛋白质。p26是一种丰富的滞育sHsp，在卤虫囊肿的胚胎发育、滞育维持和胁迫耐受中起着重要作用。迄今为止，人们对Hsp70在滞育过程中的功能知之甚少。Hsp70在卤虫滞育期的作用很少被提及。在之前的研究中，Hsp70被证明是一种提高卤虫无节幼体对各种非生物和生物应激源耐受性的必需蛋白质。本文继续研究Hsp70在滞育期间在卤虫体内的作用，目的是证明Hsp70在卵囊中存在。
方 法METHOD
1.卤虫培养卤虫培养在海水（30 mg/L盐度）下，在强曝气和恒定光照条件下孵出的囊胚，用200μm的浮游生物网收集无节幼体，然后转移到120L的玻璃纤维培养箱中。每天给无节幼体喂食无节幼体在28℃恒温通风条件下生长至成虫期。成年卤虫培养28天后采集标本进行微量注射。2.Hsp70 dsRNA的制备用Miniprep试剂盒(PureLink)从大肠杆菌过夜培养液中提取含有卤虫Hsp70 cDNA的Hsp70 dsRNA pRSET-C质粒(加拿大安大略省伯灵顿市因维特罗根™ 快速质粒Miniprep试剂盒，美国因维特罗根)。以Hsp70特异的正向(5′-TAA-TACGACTCACTA-TAGGGA-ttctcaaaagc-3′)和反向(5′-TAA-TAC-GACTCACTA-TAGGG-cataggcttgtaat-3′)引物进行PCR扩增。PCR产物作为模板，使用MEGAscript®RNAi试剂盒(Ambion Applied Biosystems，USA)生成Hsp70 dsRNA，绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA作为对照品。3.卤虫雌体注射dsRNA及胚胎发育观察选择具有未受精卵囊的成年雌性卤虫进行微量注射。雌性卤虫产生的卵囊在两个卵囊之间有一个棕色的壳腺。将雌性卤虫置于冷琼脂糖上，用微操作器（InjectMan®，Eppendorf，德国）将大约100 ng Hsp70 dsRNA注入卵囊。注射后24小时将雄性引入雌性。交配对每天用微藻、小球藻喂养，并对雌性进行受精监测。测定了雌性卤虫从受精到囊肿释放的时间。4.卤虫卵囊中Hsp70 mRNA和蛋白的检测在过滤、高压灭菌的海水中在室温下孵育至少10天，以确定在没有Hsp70的情况下，它们是否孵化并未能进入滞育期。用三色法提取囊肿总RNA™ 试剂（英国Bioline公司），按照制造商的说明进行少量修改。将注射Hsp70或GFP-dsRNA的雌性卤虫释放的20个囊肿均匀化于100μl的TRIsure中。向样品中加入20微升氯仿，剧烈涡流，并在室温下孵育2分钟。将混合物离心并将无色水相转移到新管中，然后分离RNA。用Tetro-cDNA合成试剂盒（Bioline，UK）制备单链cDNA，然后用PCR扩增并在凝胶Doc中观察。用免疫印迹法检测了先前提取过的40个蛋白。在电泳前，每道10%十二烷基硫酸钠凝胶中各取15微升，然后将其印迹到PVDF膜上（生物放射免疫印迹™ 用于抗体检测。在检测抗体反应蛋白之前，先用识别Hsp70（SMC-164D）的单克隆抗体（加拿大StressMarq）对PVDF膜进行探测，然后用多克隆HRP结合的山羊抗小鼠IgG（Bioregen-SAB-100J）（加拿大Stressgen）进行检测。5.卵囊的表型改变与代谢活性显微镜下观察，以确定注射Hsp70 dsRNA的雌性卤虫所释放的卵囊与对照组相比在形态学上是否正常。用尼康轮廓投影仪V-12B和尼康数字计数器SC-212测定卵囊直径。实验分3次进行，每次检测30个。代谢活性通过酚红试验进行评估，以确定从雌性释放后囊肿是否可行。10个囊肿，无论是否有Hsp70，在释放后立即在含有0.03%酚红、1000 U青霉素和100μg/ml硫酸链霉素（pH 8.5）的100μl试验溶液中孵育。其他含有商业生产的卵囊（INVE水产养殖，比利时）的测试溶液，通过在沸水浴中加热或测试溶液杀死。在553nm处测量了表明代谢活性的试液吸光度的变化。实验进行了两次，每个都有三个独立的卵囊样本。6.囊肿耐受性评价从注射了Hsp70或GFP的dsRNA的卤虫雌性体内收集的囊肿，在室温下在海水中孵育10天，以允许滞育进入。为了终止滞育，在干燥器中干燥卵囊4周，然后在−20°C下冷冻8周。通过孵化试验确定卵囊的耐压力性，即在室温下卵囊在海水中孵育至少10天，在此期间每天计算和移除无节幼体。7.统计分析通过进行单因素方差分析（anova），在0.05的显着性水平上确定治疗之间的显着性差异。所有数据均以这些测量值的平均值±标准差表示。所有统计分析均采用SPSS®20.0 for Windows®软件进行。
结 果RESULT
RNAi以前曾被用于检测卤虫卵囊应激耐受和胚胎发育中的功能。这些研究表明，卤虫体内存在多种热休克蛋白，其功能在不同的发育阶段可能有所不同。因此，确定Hsp70在卤虫的卵囊和早期生命阶段中是否具有功能性作用是很有意义的。本文利用RNAi技术检测了卤虫在滞育期间Hsp70的功能。用Hsp70dsRNA注射雌性卤虫后，用RT-PCR和免疫印迹法检测Hsp70mRNA和蛋白的表达。用注射对照的卤虫卵囊mRNA扩增时，RT-PCR产物在经溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳中出现一条带。然而，注射Hsp70 dsRNA的雌性卤虫卵囊mRNA的PCR产物大大减少（图1a）。免疫印迹显示Hsp70出现在注射GFP-dsRNA的雌性卤虫释放的卵囊中，而在接受Hsp70-dsRNA的雌性卤虫的卵囊中无法检测到该蛋白（图1b）。这些结果证明，RNAi敲除卤虫体内特定蛋白的有效性以及Hsp70的表达在基因和蛋白质水平上都被掩盖。
图1.卤虫卵囊中Hsp70mRNA和蛋白的敲除
接下来，确定Hsp70的减少是否会影响滞育胚胎的发育和形态。在注射后24小时，将一只雄性转移到每只雌性身上进行交配和卵子受精。记录从受精到卵囊释放的时间。注射GFP-dsRNA的雌性卤虫至少需要5天才能释放卵囊，而注射Hsp70-dsRNA的雌虫则需要大约6天的时间，但与对照组相比，时间差异不显着（p>0.05）。这些相似的结果表明Hsp70在卤虫各卵囊的发生中起着次要或非必要的作用。此外，早期发现显示，在卤虫五种已知的亚型中，一种Hsp70亚型被沉默，没有影响胚胎发育，因为雌性无节幼体的释放时间在正常时间范围内。比较而言，p26基因敲除延迟了卤虫雌体的卵囊释放。p26在囊状期、滞育期和静止期阻止蛋白质聚集，RNAi效应延长。
在确定了受精后卵囊释放的时间后，在一个轮廓投影仪下检查囊肿，以比较注射Hsp70 dsRNA的雌性卤虫释放的卵囊与对照卵囊的形态。卵囊的直径也被测量并显示在投影仪上的数字计数器上。根据观察，两种治疗方法的卵囊形态相似。呈球形，褐色，典型的卤虫卵囊特征。含Hsp70和不含Hsp70的卵囊平均直径分别为0.25±0.014mm和0.24±0.015 mm。结果表明，Hsp70基因敲除对囊肿形态无明显影响。同样，敲除1型J-结构域蛋白ArHsp40和2型J-结构域蛋白ArHsp40–2，对卵的大小和释放卵囊和无节幼体所需的时间没有明显影响。
为了确定卵囊从雌性释放后是否能存活，我们用酚红法检测其代谢活性。将10个含有Hsp70的卵囊、缺少Hsp70的卵囊和通过加热杀死的商业卵囊在含有0.03%酚红的海水中培养24小时。我们发现含有或缺乏Hsp70的卵囊在试验溶液中产生类似的颜色变化，表明它们具有代谢活性，因此被认为是活的。酚红的颜色变化是由于测试溶液被卵囊释放的二氧化碳酸化引起的。
在最后一个实验中，研究了与滞育终止相关的卵囊对压力的耐受性。通过4周干燥，然后在−20°C下干燥8周。干燥和冷冻后，71%的含Hsp70的卵囊存活，而Hsp70含量减少的卵囊，孵化显示50%存活（图2）。结果表明，Hsp70基因敲除降低了与滞育终止相关的应激耐受性（p<0.05）。其孵化率高于经RNAi降低Hsp40的孵化率。大约有20%和40%的卵囊在ArHsp40和ArHsp40–2下孵化。在另一种情况下，在与本研究相同的实验条件下，只有5%到6%的卵囊是在p26和第1组LEA蛋白敲除的情况下孵化出来的。在Hsp70被敲除的过程中，可能是由于几个因素造成的。在没有TP的情况下，Hsp70结合底物蛋白以减少非功能性蛋白形成的发生，抑制Hsp70的表达可能会在滞育终止期间破坏正常的细胞功能。据报道，在应激期间，ArHsp40和ArHsp40–2将底物输送至Hsp70，从而防止干燥、受热和氧化。Hsp70可能是Hsp110–Hsp70–Hsp40蛋白质分解系统的一部分。在sHsp p26的合作下，他们保护部分变性蛋白质不可逆变性。这些分子伴侣共同作用，促进蛋白质折叠，以拯救在压力下受损的蛋白质。在这种情况下，没有Hsp70的卵囊可能没有蛋白质存在时有效，因此在滞育终止后存活率降低。
图2.缺乏Hsp70的卵囊表现出应激耐受性降低
这项研究首次揭示了Hsp70基因敲除对卤虫卵囊的发育、形态和胁迫耐受性的影响。卵囊Hsp70的作用可能不如sHsps观察到的那样重要，但从本研究中获得的信息提供了一个明确的指示，即Hsp70存在于囊肿中，并且在滞育期间具有应激耐受性。本文的研究结果对于进一步研究Hsp70在卤虫和其他甲壳动物滞育过程中的作用具有重要意义。
扫描二维码
关注我们
获取更多信息
免责声明：Tibet Plateau-A Natural Laboratory（青藏高原生物多样性形成机制与综合利用重点实验室）尊重并倡导保护知识产权，本文所引述机构或个人的观点、言论、数据及其他信息仅作参考和资讯传播之目的，不代表Tibet Plateau-A Natural Laboratory（青藏高原生物多样性形成机制与综合利用重点实验室）赞同其观点或证实其描述。如发现违法或不良信息，请发送邮件至1021@，我们将及时处理。
如果觉得《【基因敲除】热休克蛋白70基因敲除对卤虫卵囊活力和胁迫耐受性的影响》对你有帮助，请点赞、收藏，并留下你的观点哦！
