竞争性ELISA检测猪瘟病毒抗原

猪瘟（Classical swinefever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起，主要侵袭家猪及野猪，引起高发病率、高死亡率的烈性传染病。由于其危害严重、流行分布广泛，成为国内外分子病毒学及兽医防疫研究的热点之一。CSFV属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestvirus）成员，与同属的牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、羊边界病病毒（Border disease virus，BDV）、长颈鹿瘟病毒（Giraffepestvirus），在病毒结构、抗原性和遗传特性等方面密切相关。CSFV囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白，具有种属特异性，是从事CSFV抗原性、抗原变异、特异性诊断技术、亚单位疫苗及基因工程疫苗研究的主要对象。E2蛋白存在A、B、C、D 4个不同抗原区，A区进一步划分为A1、A2、A3亚区，仅针对A1、B、C抗原区的单克隆抗体对病毒具有中和作用，但仅A1区在CSFV不同分离毒株间是保守的。E2蛋白的C末端区域内存在对所有瘟病毒属成员均高度保守的线性表位YYEPR。经连续缺失CSFV Alfort/187毒株E2基因690至910氨基酸区域，精确定位能被WH303单克隆抗体识别的CSFV特异性表位——TAVSPTTLR (829～837位氨基酸)。抗CSFV E2蛋白的单克隆抗体c2410在免疫酶染色试验中，能特异性地识别所有已知CSFV分离毒株并对病毒感染具有中和作用。张富强采用噬菌体肽库技术，将c2410识别表位精确定位于E2蛋白的832～837位氨基酸SPTTLR，为CSFV特异性线性表位（张富强博士学位论文“应用噬菌体展示技术进行猪瘟病毒结构糖蛋白E2和Erns中和抗原表位鉴定和比较”，2002）。本文在应用c2410筛选噬菌体肽库，获得与其特异性结合的噬菌体拟位的基础上，分析噬菌体拟位的免疫反应性；建立依赖c2410和噬菌体拟位的竞争性ELISA，用于诊断和检测临床组织样品中的猪瘟病毒抗原，并与国际标准的CSFV抗原捕捉ELISA比较，综合评价该技术的实用价值和推广前景，以期获得快速、敏感、特异、简便且能在基层推广普及的CSFV抗原诊断技术。

1 材料与方法

1.1 单克隆抗体、噬菌体展示随机肽库及其他试剂 c2410单克隆抗体，由德国联邦动物病毒病研究中心的E. Weiland 博士惠赠。阴性对照抗体，为CSFV阴性鼠源单克隆抗体。M13噬菌体展示的12肽随机肽库（Ph.D.-12TM Phage DisplayPeptide Library），购自美国Beverly New England生物实验室。Phage01（HL SPT M LR WEQF）、Phage02（KALY FK SPT N LR VQ）、Phage03（SIS SPT S LR WEY）、Phage04（MC SPT A LR CQAH）、Phage05（TKSQLP SPT G LR）、Phage NC（阴性对照）（QACQNNDTCPRL）噬菌体拟位由张富强应用c2410筛选12肽随机肽库获得，实验室保存。国际标准CSFV抗原捕捉ELISA试剂盒，及BVDV、BDV对照抗原，均由澳大利亚动物卫生实验室惠赠。PK-15细胞系本实验室保存。辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠抗M13抗体购自AmershamPharmacia生物技术公司；碱性磷酸酶（AKP）标记羊抗鼠IgG抗体购自Chemicon公司。其余试剂无特殊要求，均采用分析纯试剂。

1.2 噬菌体扩增及浓度滴定展示5种不同拟位基序的噬菌体及阴性对照噬菌体，分别接种30 ml处于对数生长早期的大肠杆菌（Escherichia coli）ER2738菌株悬液，37℃ 10 min后，激烈震荡培养5 h，取上清液经PEG/NaCl（20%聚乙二醇8000，2.5 mol氯化钠溶液）两次沉淀，100 μl TBS悬浮，-20℃保存备用。噬菌体悬液用TBS作10-1～10-12稀释，取100 μl稀释液与100 μl处于对数生长期的ER2738悬液混合，室温孵育20 min后，加至3 ml融化后处于42℃水浴箱保温的 Agarose Top（顶层琼脂糖营养液），立即涂布LB/Agar/Tet/Xgal/IPTG平板，37℃过夜培养，滴定噬菌体蚀斑形成单位（Plaque forming unit，PFU），计算噬菌体浓度。在所获得噬菌体浓度不低于1011 pfu/ml的前提下，以最低噬菌体浓度为基准，将所有扩增的噬菌体浓度用TBS调整至该浓度。

1.3 ELISA分析噬菌体拟位经c2410或阴性对照抗体俘获，HRP标记的鼠抗M13 抗体检测，TMB底物显色，读取450nm OD值。当样品针对c2410的OD值与针对阴性抗体的OD值存在2倍或2倍以上差异时，判为阳性，当存在3倍以上差异时，判为强阳性。

1.4免疫印迹分析噬菌体蛋白于变性条件下，经12% SDS-PAGE (Bio-Red)分离后，电转印至硝酸纤维膜上，将转印膜用含5%脱脂奶的TBST室温1 h或4℃过夜封闭后，经对应单克隆抗体检测、AKP标记的抗鼠IgG结合、BCIP/NBT底物显色，进行免疫印迹分析。

1.5竞争性ELISA 取病毒抗原稀释液或待检组织样品上清液50 μl，加至预先用c2410包被的ELISA板，37℃震荡孵育1 h，PBST0.05%洗板3～5次，加入50 μl携带不同拟位序列的噬菌体稀释液，同上法孵育、洗板，加入HRP标记的抗M13抗体稀释液，每孔50 μl，同上法孵育、洗板，TMB底物显色，读取450 nm OD值。按以下公式计算抑制率：抑制率（%）=100-（OD试验-OD阴性对照）/(OD缓冲液对照-OD阴性对照)×100，抑制率（%）>=40，判为阳性。设置阳性、阴性及空白对照，同步进行。

1.6 病毒分离与鉴定猪瘟病毒分离及鉴定方法参照文献。

1.7 竞争性ELISA反应条件优化、试验评价及临床样品检测选择获得最大抑制率（%）的噬菌体拟位，优化竞争性ELISA反应条件，滴定单克隆抗体的包被浓度和噬菌体拟位浓度，确定缓冲液空白对照OD450 nm值在1.2～1.5之间的最小抗体浓度及最小噬菌体拟位浓度，以期提高检测敏感性和特异性；选择已知实验室样品，评价所建立的竞争性ELISA的敏感性、特异性、重复性及稳定性；应用竞争性ELISA和抗原捕捉ELISA标准试剂盒同步分析76份临床样品，对竞争性ELISA的敏感性、特异性、及其与抗原捕捉ELISA的符合率进行分析、评价。两种方法检测后结果存在差异的样品，进行病毒分离鉴定确诊。

2 结果与分析

2.1 噬菌体扩增及浓度滴定扩增噬菌体Phage01-Phage05、Phage NC的浓度分别为：2.3×1011、1.7×1011、3×1011、1.2×1011、2.7×1011、2.2×1011 pfu/ml，以1.2×1011 pfu/ml为基准，将所有扩增噬菌体浓度用TBS稀释至1.2×1011 pfu/ml后，-20℃保存备用。排除因噬菌体浓度对分析结果的干扰或影响。

2.2 ELISA分析所分析的噬菌体拟位，除阴性对照(Phage NC)外，其所展示的12肽均包含SPTxLR共有基序（表1），该基序除第四位氨基酸外，与CSFV E2蛋白的832～837位（相对E2蛋白在整个多聚蛋白中所处的位置而言）氨基酸序列SPTTLR一致。ELISA分析结果表明：所有携带SPTxLR的噬菌体拟位，均为强阳性（OD+ve/OD-ve＞3）；不同拟位的OD+ve/OD-ve比值存在差异，最高值为7.43（Phage04），最低值为3.04(Phage05)；阴性噬菌体OD+ve/OD-ve比值为1.10（图1）。噬菌体拟位与单克隆抗体结合的强弱，排除噬菌体浓度差异的影响，取决于拟位本身的分子结构及其空间构象。

图1 c2410单克隆抗体筛选获得噬菌体拟位的ELISA分析（略）

2.3 免疫印迹分析免疫印迹与ELISA分析结果一致，免疫印斑颜色的深浅与OD+ve/

OD-ve比值的大小相对应（图2）。免疫印迹结果证实：ELISA分析结果是可靠的，单克隆抗体与展示于噬菌体pⅢ蛋白的表（拟）位基序发生特异性结合。

图2 c2410单克隆抗体淘选获得噬菌体拟位的免疫印迹分析（略）

2.4 竞争性ELISA分析采用已知猪瘟病毒抗原，对噬菌体拟位进行竞争性ELISA分析，确定单克隆抗体与病毒抗原结合后，对与噬菌体拟位结合的影响，进而推测猪瘟病毒天然抗原表位与噬菌体拟位对单克隆抗体的特异性结合是否处于抗体的同一抗原结合部位，以验证噬菌体拟位的特异性。结果发现：携带SPTxLR基序的噬菌体拟位与单克隆抗体c2410的结合，能被猪瘟病毒抗原特异性抑制或阻断，抑制率随病毒抗原浓度降低而降低，不同噬菌体拟位抑制率存在差异，与其对单克隆抗体c2410的亲合性相关。最高抑制率在73%～100%之间(图3，表1)。

2.5竞争性ELISA反应条件优化选择获得最大抑制率的噬菌体拟位Phage 04(MC SPT A LR CQAH)，滴定单克隆抗体包被浓度和噬菌体拟位浓度，确定缓冲液空白对照OD450 nm值在1.2～1.5之间的最小抗体包被浓度及最小噬菌体拟位浓度。单克隆抗体稀释滴度1∶200（对应抗体中和效价1∶80～1∶160，由中和过氧化物酶联试验测定，使用病毒滴度200TCID50/50 μl，稀释血清使用剂量50 μl），噬菌体拟位浓度3×1010 pfu/ml，OD+ve/OD-ve＞8。

2.6 特异性试验确定竞争性ELISA反应条件后，用于检测已知的牛病毒性腹泻病毒和羊边界病病毒抗原及健康猪、牛、羊组织样品，结果均为阴性，抑制率小于10%。表明所建立的竞争性ELISA抗原检测技术对猪瘟病毒是特异的。

图3 病毒抗原与噬菌体拟位对c2410单克隆抗体竞争性结合分析（略）

2.7 敏感性试验对8份阳性样品，用PBS作倍比稀释（1/2～1/128）后，应用所建立的竞争性ELISA和澳大利亚动物卫生实验室提供的抗原捕捉ELISA标准试剂盒进行分析，结果发现竞争性ELISA检出的最高稀释度在1/16～1/32之间，而抗原捕捉ELISA检出的最高稀释度在1/4～1/8之间。按竞争性ELISA检测阳性的最高稀释度稀释样品，进行病毒分离鉴定，结果均为阳性。表明竞争性ELISA检测结果是可靠的，且较抗原捕捉ELISA有更高敏感性。

2.8 重复性和稳定性试验固定8份阳性样品和8份阴性样品，进行板内、板间及不同保存期（1个月、3个月、6个月）重复试验。结果表明：所有样品OD450 nm值变异系数在1%～5%之间，所建立的竞争性ELISA具有良好的重复性和稳定性。

2.9 临床样品的检测和评价应用竞争性ELISA和国际标准抗原捕捉ELISA同时检测76份临床样品，部分样品进行病毒分离鉴定确诊。结果发现：所建立的竞争性ELISA与抗原捕捉ELISA标准试剂盒比较，特异性为93%、敏感性为100%，符合率96%（表2）。经统计学分析，二者检测结果无显著性差异。对竞争性ELISA检测为阳性而抗原捕捉ELISA检测为阴性的3份样品进行病毒分离鉴定确诊，结果均为阳性。结果表明：所建立的竞争性ELISA可用于临床样品中猪瘟病毒抗原检测，且较抗原捕捉ELISA具有更高敏感性。

3 讨论

3.1 采用c2410单克隆抗体淘选噬菌体展示的12肽随机肽库，获得的噬菌体拟位均携带SPTxLR基序，除第四位氨基酸外，该基序与CSFV E2蛋白的832～837位（相对E2蛋白在整个多聚蛋白中所处的位置而言）氨基酸序列SPTTLR一致。ELISA、免疫印迹分析确证其与单克隆抗体结合的特异性，且此特异性结合能被猪瘟病毒天然抗原特异性阻断和抑制。结果表明噬菌体拟位及猪瘟病毒天然抗原与单克隆抗体同一抗原结合部位发生反应，或噬菌体拟位模拟天然抗原复杂表位的空间结构或生物学功能，或SPTxLR是构成c2410单克隆抗体识别表位的关键性氨基酸基序。

3.2 目前国内外已建立多种ELISA技术，用于猪瘟病毒抗体及抗原检测，特别是抗体检测技术，在血清学调查、流行病学研究、疫苗免疫效果评估及疫病预防控制中发挥重要作用。但鉴于猪瘟病毒在我国及东南亚部分国家广泛分布，长期流行，感染动物数量众多，病毒定植并形成自身生态境圈，加之疫苗的大面积使用，抗体检测结果不能反应当前动物个体及群体的感染、带毒状况，难以揭示疫病发生、发展、分布、流行规律，远不能满足当前生产实际的需要，严重并将长期制约我国猪瘟的防制和净化进程。采用单克隆抗体作为包被抗体或检测抗体建立的荧光抗体试验或抗原捕捉ELISA，具有高特异性，但通常敏感性较低，而采用多克隆抗体虽可获得高敏感性，但特异性较低。竞争性ELISA具有高敏感性和高特异性的优点，在各种疫病抗体检测中发挥了重要作用，并已开始在毒素蛋白和抗原检测中得到应用。

噬菌体将CSFV特异性表（拟）位基序展示于其次要蛋白pⅢ，与猪瘟病毒抗原竞争性地与单克隆抗体发生结合，鉴于次要蛋白pⅢ在每个成熟噬菌体颗粒表面仅含3～5个拷贝，而主要蛋白pVⅢ则存在2 000～3 000个拷贝，存在“放大效应”（1个次要蛋白pⅢ的结合差异，反应到主要蛋白pVⅢ，则至少为400～600倍的结合差异）。本研究基于单克隆抗体、抗原表位的特异性和噬菌体拟位的“放大效应”，以单克隆抗体为包被抗体，以噬菌体拟位为“竞争指示剂”，以抗M13噬菌体主要蛋白pVⅢ的特异性抗体(标记HRP)为检测抗体，建立竞争性ELISA，用于猪瘟病毒抗原检测，经试验证实是可行的。

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